参芍胶囊对心肌缺血再灌注损伤大鼠炎症反应的影响

赵桂峰 黄欣玮 毛静远 吴丽玉

(天津中医药大学第一附属医院心血管科，天津 300193)

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)指缺血心肌组织在血液重新灌流后，出现细胞代谢功能障碍或结构破坏反而加重的现象。炎症反应是MIRI重要机制之一。再灌注后中性粒细胞(PMNs)浸润、聚集，释放细胞炎症因子、氧自由基，导致细胞损伤。参芍胶囊由人参茎叶皂甙和白芍制成的中成药制剂，是治疗冠心病的国家中药保护品种。本研究探讨参药胶囊及有效成分对MIRI大鼠PMNs浸润和炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 成年健康的雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔许可证号：SCXK(京)2012-0001〕。所有大鼠饲养于中国医学科学院放射医学研究所，具有良好通风和空气过滤系统，将大鼠按体重编号后，室温20～25℃，相对湿度40%～60%，给予普通大鼠饲料喂养，自由饮水，日照采用日光灯12 h开关循环进行，观察3 d后进入实验。

1.2试剂与仪器 参芍胶囊(SS)(由人参茎叶皂甙和白芍组成，保定天浩制药有限公司提供，批号150701)，人参茎叶总皂苷(TSFG)、白芍浸膏粉(Pae)(保定天浩制药有限公司提供)，阿托伐他汀(Ator)钙片(辉瑞制药有限公司提供，批号L14582，规格20 mg)，肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-10试剂盒(美国Uscn Life science Inc 公司，批号分别为SEA133Ra，SEA563Ra,SEA056Ra)，Spectra Max190型酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

1.3动物模型制备与评价 各组大鼠于术前禁食12 h，自由饮水，记录体重，用5%水合氯醛(6 ml/kg)腹腔注射麻醉。2～5 min后，仰卧位固定，消毒左侧胸前及腋下皮肤，胸部备皮。记录Ⅱ导联心电图。沿左侧第3、4肋间(或心脏搏动最明显处)剪开左胸皮肤约1 cm，用止血钳逐层分离皮下组织。在心脏搏动最明显处用弯止血钳撑开胸廓，将心脏挤出胸腔，持5/0无创缝合针丝线，于肺动脉圆锥与左心耳之间，在离左冠状动脉前降支起始部约2 mm处进针，深度大约1 mm，在结扎处预先垫一根1/0粗棉线，而后把冠状动脉及棉线一起进行结扎，第二结为滑结，随后立即把心脏送回胸腔并排气净血，再用直头止血钳夹闭皮肤及肌肉层，造成心肌缺血。心电图示ST段抬高并与T波融合，结扎线下心肌组织发绀，说明心肌缺血模型成功。30 min后，松开止血钳，恢复血流灌注，出现再灌注心律失常，标志再灌注成功。见图1。其中假手术组在左冠状动脉前降支下只穿线不进行结扎。

图1 大鼠造模不同时间点心电图变化

1.4分组与给药 将70只Wistar大鼠按体重随机分为假手术组，缺血再灌注(I/R)组，SS 250 mg/kg(SS250)组，SS 500 mg/kg(SS500)组，TSFG组，Pae组和Ator组共7组，每组10只。SS组剂量依据人与大鼠体表面积换算，用0.9%生理盐水配制成浓度分别为25 mg/ml和50 mg/ml溶液。每1 000粒SS(0.25 g/粒)中含TSFG 13 g，Pae 185 g。SS 500 mg/kg对应TSFG溶液浓度为2.6 mg/ml，Pae溶液浓度为37 mg/ml。Ator组溶液浓度为1 mg/ml。假手术组和I/R组予等量生理盐水。预灌胃1 w，每天上午给药1次，自由饮食饮水。术前1 h末次给药。

1.5中性粒细胞计数 将心脏取结扎线下1～2 mm部位，横切2～3 mm厚度的组织固定，常规脱水，包埋，切片，HE染色，中性树胶封片后，每组大鼠各取一张切片，每张切片随机取3个视野，每组共计观察6个视野，计算PMNs数量，然后取其均值。

1.6酶联免疫吸附法检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-10 左室插管结束后进行大鼠腹主动脉取血6 ml，置于37℃水浴2 h，之后3 000 r/min，15 min进行离心，取上清，分装后-80℃保存。具体操作按照试剂盒说明书进行。酶标仪在450 nm波长测光密度。以标准品浓度为纵坐标，OD值均值为横坐标作图，即得标准曲线，根据标准曲线计算各样品浓度。

1.7统计学处理 采用SPSS21.0软件进行方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1心肌组织病理学形态变化 假手术组可见左室外膜局部区域心肌细胞轻度水肿，少量炎细胞浸润；I/R组可见左室大部分区域心肌细胞重度水肿及大量的炎细胞浸润，外膜局部区域可见灶性坏死；SS250组和Pae组左室大部分区域(1/2以上)中度水肿，炎细胞浸润，外膜区域可见散在的灶性坏死；TSFG组左室部分区域可见轻到中度的心肌细胞水肿，炎细胞中度浸润；SS500组及Ator组左室心肌细胞水肿程度有所减轻，可见炎细胞浸润，无灶性坏死。见图2。

(黑色箭头:炎细胞浸润；白色箭头:细胞水肿)图2 各组心肌HE染色(×400)

2.2中性粒细胞计数 与假手术组〔(18.53±0.84)个/视野〕比较，各组MIRI大鼠心肌组织中PMNs数量显著升高〔I/R组(33.44±1.22)个/视野、SS250组(18.78±0.84)个/视野、SS500组(19.50±0.69)个/视野、TSFG组(22.33±1.29)个/视野、Pae组(29.33±0.82)个/视野、Ator组(28.60±1.01)个/视野，P<0.01〕。与I/R组比较：用药各组PMNs数量显著减少(P<0.05，P<0.01)。与Pae及Ator比较：SS250组、SS500组和TSFG组PMNs数量显著减少(P<0.01)。与TSFG组比较，SS250、SS2500组PMNs数量显著减少(P<0.05)。

2.3各组血清中炎症因子的变化 与假手术组比较，I/R组TNF-α浓度显著升高(P<0.01)。与I/R组比较，SS250组、SS500组、TSFG组TNF-α浓度明显降低(P<0.01，P<0.05)。与假手术组比较，I/R组IL-1β浓度明显升高(P<0.05)。与I/R组比较，SS250 组、SS500组、Pae组和Ator组IL-1β浓度明显降低(P<0.05)；TSFG组差异无统计学意义(P>0.05)。用药组之间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，I/R组IL-10浓度显著下降(P<0.01)。与I/R组比较，SS250组、SS500组IL-10浓度明显升高(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较

与假手术组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与I/R组比较:3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨 论

炎症反应是介导MIRI的重要机制之一。PMNs在炎症反应中扮演重要角色。MIRI过程中PMNs被激活并黏附于血管内皮细胞，导致内皮细胞水肿和功能障碍，毛细血管腔堵塞，发生无复流现象。其中活化的PMNs可诱发细胞膜磷脂A2释放大量花生四烯酸，产生炎症介质〔1〕。其中TNF-α是启动炎症级联反应的关键因素。主要作用有抑制心肌收缩力；诱导多种炎症因子和黏附分子的产生；诱导心肌细胞凋亡。抑制TNF-α的表达可以减轻MIRI程度。IL-1β是单核巨噬细胞分泌的炎症因子，广泛参与机体缺血缺氧、炎症、应激的调控。其参与MIRI的过程主要作用有介导PMNs与血管内皮细胞黏附因子的表达，促进PMNs的迁移及浸润，加剧炎症反应及微血管阻塞；同时与TNF-α具有协同作用，诱导心肌细胞凋亡，产生心肌毒性作用。所以TNF-α和IL-1β是MIRI发生时两种最重要的促炎因子〔2〕。而细胞因子IL-10是由各种淋巴细胞产生炎症抑制因子。抑制促炎因子的过度表达，在下调炎症反应，减轻心肌损伤中发挥关键作用。虽然炎症反应在MIRI过程中会对心脏产生不利的影响。但应用糖皮质激素抑制机体的炎症反应则不利于心脏组织修复和功能恢复。所以，炎症是把“双刃剑”。如何利用中医药的“多靶点，多环节”的优势进行干预，双向调节，趋利避害，才是中医药防治MIRI的研究重点。目前中医药复方、有效组分等的研究已经显示了良好的基础和临床效果〔3〕。

SS组方精简，以人参为君药，益气养阴；《本经》云：“主补五脏，安精神，止惊悸，除邪气，明目，开心益智。”《药性论》云：“主五脏气不足，五劳七伤，虚损瘦弱……补五脏六腑，保中守神。”白芍为臣药，行瘀止痛，养血和阴。《本经》云：味苦，平，主治邪气腹痛，除血痹，破坚积……利小便，益气。两药合用,共奏益气活血，化瘀止痛之功效。

本研究中发现，SS及其成分均能够抑制PMNs的浸润。虽然两种剂量无统计学差异，但高剂量组显示更好的作用趋势。其中，TSFG作用好于Pae，体现方剂中君药的核心作用。其次，SS具有抑制促炎因子TNF-α、IL-1β，提高抗炎因子IL-10生成的作用，且无剂量依赖性。而Pae和TSFG分别对TNF-α及IL-1β无明显抑制作用。揭示SS两种成分分别作用于不同的炎症因子产生抗感染作用。体现了中医药的多靶点协同整合作用的优势。再次，SS复方具有促进抗炎因子IL-10产生的作用，而其单一组分却无明显作用。进一步揭示SS两种成分的协同作用，整体作用是多种成分微作用的整合，是“合力”。但多靶点作用并不是简单地成分堆积。只有在中医理论指导下的方剂配伍才能成为有机的多靶点组合。有效组分的作用机制研究也是中医配伍理论科学内涵的研究重点之一。对于该药的研究必须针对MIRI发生不同阶段的病理生理机制，进一步深入研究其有效组分和干预机制。