基于楚雄腮扁叶蜂产卵行为的云南松针叶挥发性物质分析

陈 敏, 刘方炎, 李永和(1.西南林业大学生命科学学院；.西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室；.中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 6504)

楚雄腮扁叶蜂(Cephalciachuxiongica)隶属膜翅目(Hymenoptera)扁叶蜂科(Pamphiliidae)腮扁叶蜂属(Cephalcia)，是近年来云南省新发现的重大食叶害虫，主要危害云南松(Pinusyunnanensis)、华山松(Pinusarmandii)等松科植物的针叶[1].该虫自1984年首次报道以来，先后在云南省的20个县市和四川会理陆续发生危害.起初危害面积不超过66.7 hm2，如今仅在云南省楚雄州境内的危害面积就已达1 333 hm2以上，造成严重的经济损失[2].其幼虫取食松树针叶，吐丝形成灰白色幕巢，影响树木正常生长，造成树木畸形，且为害后树势衰弱，易引发小蠹虫等次期性害虫的侵害，严重时导致寄主死亡，给防治带来极大困难[3].

昆虫在其寄主植物上的产卵选择性是其与寄主植物及其周边环境长期协同进化的结果，对其种群的生存繁衍具有重要的生物学意义[4].寄主植物的气味是影响昆虫对寄主植物选择的一个重要因素[5].寄主植物能够释放出较高浓度的挥发物，雌虫通过嗅觉感受这些挥发性物质来寻找适合产卵的寄主植物及部位[6-8].松实小卷蛾(Retiniacria)雌蛾可在思茅松新鲜针叶上顺利产卵，在衰弱针叶或没有针叶的条件下则不产卵，新鲜针叶所含的挥发性物质对其产卵有刺激作用[9].曾鑫年等[10]发现，寄主植物幼嫩叶中的挥发性化学物质对柑橘潜叶蛾(Phyllocnistiscitrella)成虫产卵有明显的引导作用.目前，已有学者发现楚雄腮扁叶蜂雌蜂对云南松针叶粗提物有明显的趋向反应[11].但有关引诱楚雄腮扁叶蜂产卵的云南松针叶健康程度及其挥发性成分尚未见报道.本试验以云南省寻甸县北大营村采集的楚雄腮扁叶蜂为试验对象，室内测定其在健康松针和衰弱松针不同部位的产卵量及其对松针不同部位挥发性物质的趋向率，并提取健康松针和衰弱松针不同部位的挥发性物质进行生物测定，试图从化学生态学角度分析影响楚雄腮扁叶蜂产卵选择性的因素，以期为防控楚雄腮扁叶蜂提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

楚雄腮扁叶蜂和健康、衰弱云南松均采自云南省寻甸县北大营村(N 25°18′、E 103°12′，海拔1 870 m)云南松林.健康松针和衰弱松针判断标准：健康松针采自当年生云南松，树势健壮，松针颜色翠绿，有光泽；衰弱松针采自当年生云南松，树势衰弱，针尖发黄，颜色暗哑，无光泽.

1.2 楚雄腮扁叶蜂室内产卵试验

在100 cm×100 cm×80 cm的养虫笼中进行试验，养虫笼温度为20～28 ℃，湿度(70±10)%.将长约60 cm的健康云南松枝条和衰弱云南松枝条分别插入2个盛水的广口瓶中，放入不同的养虫笼中央.每个养虫笼中放入羽化2 d的已交配的雌蜂5头，24 h后统计松针尖端、中部和基部的产卵量.每个处理设5个重复.松针尖端、中部和基部的划分标准：尖端取自距叶尖1.50 cm处，基部取自距根部1.50 cm处，其余为中部，长7～10 cm.

1.3 云南松针叶挥发性物质的提取

将松针按尖端、中部、基部截取为3段(划分标准同1.2).分别提取健康松针和衰弱松针尖端、中部、基部的挥发性物质.每个部位设3个重复.

松针挥发性物质提取采用水蒸气蒸馏萃取法[12].取健康松针和衰弱松针的尖端、中部、基部各100 g 剪碎后分别放到1 000 mL的蒸馏瓶中，加400 mL蒸馏水，水蒸气蒸馏4 h.馏分用乙醚萃取，无水硫酸钠干燥24 h.提取的松针油用于“Y”型嗅觉仪生物测定和GC-MS分析.

1.4 “Y”型嗅觉仪生物测定

取羽化2 d已交配的雌蜂测试其对云南松针叶不同部位挥发性物质的行为反应，生物测定方法参照文献[11].将10头试虫放入“Y”型嗅觉仪主管入口处，启动真空泵，5 min后检查试虫的趋向行为.如果试虫进入气味源的支管，则记为正趋向；试虫进入对照的支管，则记为负趋向；如果停留在主管中，则记为无选择.

趋向率/%=(正趋向试虫数/总试虫数)×100.

1.5 挥发性物质含量的测定

松针提取物分析测试在TRACE DSQ GC/MS联用仪上进行.

GC条件：色谱柱为DB-17(30.0 m×250 μm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温40 ℃(保留3 min)，40 ℃·min-1升温到130 ℃，2 ℃·min-1升温到160 ℃，20 ℃·min-1升温到280 ℃，保持3 min.汽化室温度230 ℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压5.08 psi，载气流量1.0 mL·min-1；进样量1 μL；分流比40∶1.

MS条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 982 V；接口温度280 ℃；质量扫描范围(m/z) 10～450.

1.6 数据处理

挥发物数据处理与分析通过HPMSD化学工作站数据处理系统完成，利用色谱峰面积归一法，测得各化学组分在挥发油中的质量分数，再经GC-MS测定，运用NIST质谱数据库进行自动检索、解析，确认其化学成分.楚雄腮扁叶蜂平均产卵量及其对松针不同部位的趋向率，以及松针不同部位挥发性物质含量的方差分析采用SPSS 17.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)中单因素方差分析(one-way ANOVA)完成，并利用Duncan′s多重比较及t检验对试验数据进行差异显著性分析，数据结果以“平均值±标准差”表示.

2 结果与分析

表1 楚雄腮扁叶蜂雌蜂在松针不同部位的产卵量1)Table 1 Oviposition amount of female C.chuxiongica on different parts of pine needles

1)同列数值后附不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著(P<0.05).

表2 楚雄腮扁叶蜂雌蜂对松针不同部位挥发物的趋向反应1)Table 2 Taxis responses of female C.chuxiongica to volatile oil in different parts of pine needles

1)同列数值后附不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著(P<0.05).

2.1 楚雄腮扁叶蜂雌蜂在松针不同部位的产卵量

由表1可知，楚雄腮扁叶蜂雌蜂在健康针叶和衰弱针叶不同部位的产卵量差异显著(P<0.05).健康松针尖端、中部和基部的产卵量均显著多于衰弱松针对应部位的产卵量；在健康松针上，雌蜂在中部的产卵量最高，达(42.17±9.20)粒，显著高于尖端和基部的产卵量.

2.2 楚雄腮扁叶蜂雌蜂对松针不同部位挥发性物质的趋向反应

由表2可知，楚雄腮扁叶蜂雌蜂对健康松针中部挥发性物质表现出明显的趋向反应，趋向率高达(68.33±10.20)%，显著高于其对健康松针尖端和基部，以及衰弱松针各部位挥发性物质的趋向率(P<0.05)；雌蜂对衰弱松针基部挥发性物质的趋向率为0.由此表明，云南松健康针叶中段挥发性物质对楚雄腮扁叶蜂雌蜂具有很强的引诱作用.

2.3 健康松针和衰弱松针不同部位挥发物种类及挥发量的差异

健康松针和衰弱松针不同部位共鉴定出27种挥发物(表3).由表3可见，健康松针和衰弱松针不同部位挥发物的种类及挥发量存在差异.健康松针尖端共鉴定出14种挥发物，而衰弱松针尖端鉴定出的挥发性物质为19种.其中，健康松针尖端β-蒎烯、石竹烯、双丁噁唑、2-(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基-1-苯基乙基)苯酚、棕榈酸、油酸的挥发量显著高于衰弱松针，β-榄香烯、α-石竹烯、毕澄茄烯的挥发量显著低于衰弱松针(P<0.05).健康松针中部检测到的挥发物有15种，衰弱松针中部鉴定出了20种挥发性物质.其中，健康松针中部的β-蒎烯、石竹烯、β-杜松烯、双丁噁唑、2-(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基-1-苯基乙基)苯酚、棕榈酸的挥发量显著高于衰弱松针，而毕澄茄烯的挥发量显著低于衰弱松针(P<0.05).健康松针基部检测到的挥发物种类为16种，衰弱松针基部检测到的挥发物种类为12种.其中，健康松针基部β-蒎烯、乙酸异龙脑酯、β-榄香烯、石竹烯、α-石竹烯的挥发量显著高于衰弱松针，而毕澄茄烯、2-(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基-1-苯基乙基)苯酚的挥发量显著低于衰弱松针(P<0.05).

由表3还可见，与衰弱松针相比，健康松针不同部位释放的挥发性物质，除挥发量发生显著变化外，还产生特异性挥发物：在健康松针尖端检测到乙酸异龙脑酯、杜松烯、邻苯二甲酸二异辛酯等衰弱松针尖端没有的特异性组分；中部检测到3-蒈烯、乙酸异龙脑酯、杜松烯、对苯二甲酸二(2-乙基己)酯等；基部检测到α-蒎烯、杜松烯、双丁噁唑、金合欢醇、棕榈酸、油酸等.在衰弱松针尖端和中部也检测到α-蒎烯、柠檬烯、萜品油烯、1-乙烯基-1-甲基-4-丙-2-亚基-2-丙-1-烯-2-基环己烷、衣兰烯、惹烯等特异性组分；在衰弱松针基部检测到β-杜松烯、卡达烯、间苯二甲酸二(2-乙基己基)酯等健康松针基部所没有的组分.

3 讨论

在植食性昆虫的生命周期中，产卵是其繁衍后代、维持种群数量的重要环节.一般认为，亲代雌成虫的产卵具有选择性，其产卵场所有利于后代个体的存活和生长发育[13].曾鑫年等[10]观察发现，柑橘潜叶蛾选择在嫩叶上产卵，在蕉柑上选择产卵的叶片长度为1～3.3 cm，橙类的叶片长度为1～4.5 cm，在超过以上长度的嫩叶上极少产卵.刺桐姬小蜂(Quadrastichuserythrinae)雌蜂最喜欢产卵于长1～2 cm的未展开或半展开的刺桐幼嫩叶片上，当新梢叶片大于3.5 cm时不产卵[14].本研究发现，楚雄腮扁叶蜂雌蜂选择在健康松针上产卵，且在健康松针中部的产卵量最高.通过“Y”型嗅觉仪的生物测定，进一步确定楚雄腮扁叶蜂雌蜂对健康松针尤其是健康松针中部挥发性物质表现出明显的趋向反应.生物测定结果与室内产卵试验结果一致.

表3 云南松健康针叶和衰弱针叶不同部位挥发性物质含量1)Table 3 Content of volatile substance released from different parts of pine needles of health and weak P.yunnanensis

1)不同小写字母表示松针不同部位的同种挥发物含量差异显著(P<0.05)；*表示同种挥发物含量在健康松针、衰弱松针之间差异显著(P<0.05).

寄主植物挥发性物质在雌成虫产卵定位过程中发挥了重要作用[15].已有研究表明，寄主植物欧洲赤松中的β-蒎烯、柠檬烯和月桂烯是决定欧洲赤松叶蜂(Diprionpini)雌蜂产卵的主要因素[16].对欧洲新松叶蜂(Neodiprionsirtifer)雌蜂产卵研究发现，柠檬烯浓度较高，对欧洲新松叶蜂雌蜂产卵具有驱避作用，但浓度较低时则具有引诱作用[17].对松实小卷蛾雌蛾产卵研究发现，健康思茅松针叶和衰弱针叶挥发物含量和种类存在差异，松实小卷蛾只在具备健康思茅松针叶的条件下才产卵[9].本研究发现，云南松健康松针不同部位挥发性物质含量存在显著差异.健康松针中部的挥发性物质β-蒎烯和双丁噁唑含量显著高于尖端和基部，杜松烯则明显低于尖端和基部.这可能是造成雌蜂在健康松针中部有较高的产卵量并对中部挥发物有较高趋向率的一个重要原因.另外，与衰弱松针中部相比，健康松针中部存在3-蒈烯、乙酸异龙脑酯、杜松烯、对苯二甲酸二(2-乙基己)酯等特异性挥发物.这可能是造成雌蜂在衰弱松针中部的产卵量和对其挥发物趋向率显著低于健康松针中部的原因之一.但究竟是哪种挥发物在楚雄腮扁叶蜂产卵选择上起主要作用，以及如何利用云南松健康针叶和衰弱针叶挥发性物质的差异来控制楚雄腮扁叶蜂的产卵和危害，有待进一步研究.