白腐真菌与嗜热性侧孢霉复配对棉花秸秆降解的影响

王 益，李春越，韩雅娇，杨宝和，马 多，贾宏涛

1. 中国科学院地球环境研究所，西安 710061

2. 陕西师范大学 地理科学与旅游学院，西安 710119

3.新疆农业大学 草业与环境科学学院，乌鲁木齐 830052

秸秆是成熟农作物茎叶（穗）部分的总称，通常指棉花、小麦、玉米、水稻和其它农作物在收获籽实后的剩余部分。农作物光合产物有50%以上存在于秸秆中，秸秆富含氮、磷、钾和有机质等，是一种具有多用途可再生的生物资源（杨文钰和王兰英，1999）。我国是一个农业大国，各类农作物秸秆资源十分丰富，农作物秸秆资源拥有量居世界首位，而且其生产量逐年增加。如果这些农业固体废弃物得不到有效的利用和处理，不但造成资源浪费，更会引起环境污染等问题。

我国是世界上最大的棉花（Gossypium hirsutum L.）生产国，棉花种植面积、单产和总产量均居世界首位，棉花产量约占世界总产量的1/4（喻树迅和王子胜，2012），在棉花种植生产过程中会产生数量巨大的棉花秸秆。棉花秸秆具有密度大、韧性强、适口性差、不利于动物消化吸收和不适合加工成饲料的特点，同时运输和贮存也存在一定困难，除了用作造纸、制板、生产燃料和培养食用菌外，棉花秸秆还田仍旧是比较常见的主要处理方式，但还田的棉花秸秆不能快速自然降解，严重影响到次年棉花的播种和出苗（张琴等，2011）。

棉花秸秆在农田自然环境中的降解受到秸秆自身结构、物质组成（郑秋生等，2010），田间土壤环境如土壤质地、土壤水分含量、土壤含盐量、秸秆田间埋藏深度（贾宏涛等，2007）和棉花秸秆粉碎程度的影响（韩雅娇等，2014a）。促进秸秆田间降解的常见措施是通过改变土壤理化性质、控制棉花秸秆粒度和添加外源碳、氮、磷等以提高还田秸秆的降解。添加微生物菌剂也是提高还田棉花秸秆降解的方法，Bumpus et al（1985）发现白腐真菌典型种黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）在一些主要营养物质受到限制时，可形成木质素过氧化物酶（Lip）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac），通过一系列酶促反应对各种异生物质具有独特降解能力，可以对底物实现部分或彻底氧化。白腐真菌被广泛应用于发酵饲料（李天歌等，2013）和废水处理（谢静茹等，2016）等领域，被公认为是对木质素降解效果最好的微生物（Beguin and Aubert，1994）。嗜热性侧孢霉（Sporotrichum thermophile）是一类对纤维素具有优秀降解能力的丝状真菌，可使作物秸秆在较短时间内腐烂，其最适生长温度为45 — 50℃，最高生长温度为55℃（许燕等，2008）。韩雅娇等（2014b）通过43 d培养试验初步进行了白腐真菌和噬热性侧孢霉等菌剂对棉花秸秆降解效果的对比，并研究了不同菌种在施加营养液和碱预处理下对棉花秸秆的降解效果，结果表明白腐真菌和嗜热性侧孢霉对棉花秸秆的降解效果优于现有商品化的复合菌剂；在碱预处理并施加营养液条件下白腐真菌对棉秆木质素降解效果最好，降解率达到29.41%，而嗜热性侧孢霉对棉秆纤维素的降解效果最好，降解率可达30.54%。

新疆地处欧亚大陆腹地，年降水量少、日照充足、积温高、无霜期长、昼夜温差大、病虫害少，是世界上高产棉区，也是中国棉花种植生产的重点区域，其种植面积占全国1/4，总产量约占全国1/3（李传想和宋友桂，2014；李云等，2014；张翠燕等，2016）。如何处理和快速降解还田棉花秸秆成为一个急需解决的生产实际问题（贾宏涛等，2007）。本实验是在前期研究工作的基础上，通过室内盆栽实验研究白腐真菌和嗜热性侧孢霉菌株复配对棉花秸秆的降解效果，并设计正交试验筛选出复配菌剂降解棉花秸秆的最优条件组合，最后根据室内模拟实验所得结果进行大田试验测试，以验证复合菌剂的实际应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

白腐真菌由西安工程大学微生物实验室提供，嗜热性侧孢霉从市场上购置。

1.1.2 棉花秸秆

棉花秸秆采集自位于新疆乌鲁木齐市乌鲁木齐县安宁渠镇的新疆农业科学院灰漠土长期定位试验基地。采集回来的棉花秸秆清洗后置于烘箱中60℃烘48 h，经粉碎机粉碎过2 mm筛备用。棉花秸秆中木质素含量为30.08%，纤维素含量为38.21%，酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量为69.39%。

1.1.3 培养基

PDA 固体培养基：马铃薯 200 g ∙ L−1，葡萄糖 20 g ∙ L−1， 琼 脂 18 g ∙ L−1，K2HPO43 g ∙ L−1，MgSO4∙ H2O 1.5 g ∙ L−1， 维 生 素 B1微 量， 自 然pH。营养培养基（BPB）：牛肉膏 5 g ∙ L−1，蛋白胨 10 g ∙ L−1，氯化钠 5 g ∙ L−1，pH 调节为 7.2。

1.2 研究方法

1.2.1 菌株培养

将在4℃保存下的白腐真菌菌种接种在PDA培养基上，在30℃培养箱中培养10 d进行扩大培养。培养结束后，选取纯净光滑的菌落，在无菌操作台上用接种环刮取孢子接种至装有灭菌营养培养基的三角瓶中，加塞密封。再将三角瓶放入摇床以300 rpm震荡30 min后制成孢子悬浮液（经血球计数板准确计数后，用无菌生理盐水调节孢子悬液浓度为 106个 ∙ mL−1）在 4℃下保存备用。

在无菌操作台上用接种环挑取嗜热性侧孢霉干剂涂抹于PDA培养基上，45℃下培养箱中培养10 d，湿度保持在60%以上以防止培养基水分的大量蒸发而干裂，孢子悬浮液的制备方法同上，用无菌生理盐水调节孢子悬液浓度为106个 ∙ mL−1备用。

1.2.2 菌株复配拮抗试验

将白腐真菌和噬热性侧孢霉两种菌株做拮抗实验，具体操作方法：将两种菌株各挑取少量菌落于PDA培养基平板上，围绕中心点相距3 cm处进行接种，30℃下恒温培养5 d，期间每隔12 h观察菌种间有无互相抑制菌丝生长、孢子生成、菌落生长等情况，如果接种的两种菌株生长在一起说明这两种菌之间无拮抗反应，如果接种的菌株分开生长，中间有明显的间隔，说明这两种菌存在拮抗现象。

1.2.3 菌株复配降解棉花秸秆最优条件正交试验

试验采用L9(34)正交表，设计了四种实验因子：温度、氮素添加量、菌种、料水比，每个因子分别设置三个水平（表1）。室内试验过程中所有操作均在无菌环境中进行。具体如下：在超净工作台上，将经粉碎灭菌的棉花秸秆装入无菌烧杯中，根据试验设计分别接入无菌水和定量菌液，调节氮素浓度后用无菌封口膜封住防止水分流失，并用无菌打孔器在封口膜上打孔以便通气。将所有处理置于相应温度的培养箱中，调节湿度进行培养，为避免污染，这些培养箱为降解试验专用培养箱。空气湿度调节在65% — 75%。降解周期40 d结束后测定纤维素、木质素和酸性洗涤纤维含量，筛选出棉秆降解的最优条件。接种量（质量分数，孢子悬液占总物料质量的比例）为：嗜热性侧孢霉15%、白腐真菌5%、复合菌剂10%。

表1 L9(34)正交试验因素及水平设计表Tab.1 The orthogonal experimental design of L9(34)

1.2.4 菌株复配降解棉花秸秆大田验证实验

试验于2013年10月22日 — 2013年12月11日在新疆乌鲁木齐土壤与肥料试验基地进行，试验所在试验田土壤类型为灰漠土，土壤有机质含量为5.87 g ∙ kg−1、碱解氮含量为 70.07 mg ∙ kg−1、速效磷含量为 30.40 mg ∙ kg−1、速效钾含量为 87.78 mg ∙ kg−1。

试验棉花秸秆采集自当地，剪成约2 — 3 cm备用。将事先准备好的棉花秸秆装入网袋（孔径为1 mm）中，每个网袋内装入大约20 g，连袋称重并记录。试验分为对照组和施菌组（白腐真菌和噬热性侧孢霉复合菌剂），每组共5个重复，每5个重复设置为一个区组，田间随机布设3个区组。

对照组编号为A1—A15，直接将装有棉秆的网袋埋入棉田距地表20 cm深处，不施加肥料，不额外浇水，自然pH值，做下标记；施菌组编号为B1—B15，采用尿素配置成含氮量为3%的肥水，加入菌液，每个重复喷施50 mL左右肥水（参考正交试验结果应喷施30 mL左右，考虑到渗透到土壤中的流失部分，酌情喷施50 mL），同样埋入20 cm深处，做好标记，随时观察土壤湿度，使土壤湿度始终保持在60%左右。埋好样品后，分别于第10 d、20 d、30 d、40 d、50 d从各处理中取样，取出的网袋用清水冲洗至无色为止，85℃烘干并称重，采用差重法计算秸秆降解率。

1.2.5 测试方法

秸秆木质素、纤维素、酸性洗涤纤维（ADF）含量采用Van Soest et al（1991）法进行测定。

1.3 数据处理

采用Excel 2003软件对试验数据进行统计分析。

图1 白腐真菌与嗜热性侧孢霉的拮抗试验Fig.1 Antagonism experiment between white rot fungi and Sporotrichum thermophile

2 结果与分析

2.1 秸秆降解菌复配

菌种拮抗试验结果显示白腐真菌和嗜热性侧孢霉没有发生拮抗现象，可以共存，见图1。白腐真菌生长健康，略带酸味，试验培养第3 d两种菌落的边缘开始相交，但是两菌株的生长并未受到限制。嗜热性侧孢霉菌落表面开始生长出白色菌丝，第5 d出现褐色的分生孢子，两种菌生长在一起，相交的部分呈现浅褐色。根据这个现象断定两种菌可以进行复配，为进行下一步试验奠定了基础，挑取两种菌株相交部分作为复合菌剂，用作下一步降解实验研究的接种材料。

表2 正交试验各指标测定结果Tab.2 Analysis results for each index of the orthogonal experiment

2.2 菌株复配降解棉花秸秆最优条件正交试验

棉花秸秆降解效果的优劣是由降解后棉秆中木质素和纤维素含量共同决定的，含量越低说明降解效果越好。本研究采用L9(34)正交试验（实验设计见表1）研究棉花秸秆分别在白腐真菌、嗜热性侧孢霉和复合菌剂降解40 d后木质素、纤维素和酸性洗涤纤维含量，结果见表2。实验结果表明：通过外加菌剂处理后棉花秸秆木质素、纤维素和酸性洗涤纤维含量均比处理前降低，各处理中木质素含量减少最多的为处理6，减少了6.73%；试验处理1中棉秆纤维素含量减少的最多，为8.61%；酸性洗涤纤维含量在处理7中减少最多，减少量达到10.73%。通过相关性分析得出，纤维素和酸性洗涤纤维含量与氮浓度极相关。

本研究中降解木质素最优条件组合是A2B3C3D2，影响因素重要程度依次是料水比＞菌种＞氮含量＞温度；降解纤维素最优组合是A3B1C1D1，影响因素依次是氮含量＞料水比＞菌种＞温度；降解酸性洗涤纤维最优组合是A3B1C3D1，影响棉花秸秆降解效果的因素依次为氮含量＞菌种＞料水比＞温度。综合考虑各各因子对棉秆中木质素、纤维素和酸性洗涤纤维的降解效果，最优组合条件是A3B1C3D1，即温度为45℃、氮含量为3%、料水比为1/2时，在复合菌系作用下棉花秸秆的降解效果最好，结果见表3。

表3 正交试验各指标极差分析结果Tab.3 Index range analysis results of the orthogonal experiment

2.3 菌株复配降解棉花秸秆大田验证实验

在白腐真菌和噬热性侧孢霉菌株复配室内降解棉花秸秆最优条件正交试验的基础上，进一步开展复配菌株在田间降解棉花秸秆的实际效果研究，实验结果如图2所示。在为期50 d的实验过程中，对照组（不施菌）和施菌组的棉秆降解率均随降解时间延长呈现上升趋势，施菌组处理的棉花秸秆降解率总体上比对照组高，在40 d以后施菌组和对照组中棉花秸秆降解率差异达到显著水平，降解周期结束后对照组棉花秸秆降解率为26.43%，施菌组为29.93%。

降解实验期间施菌处理的棉花秸秆降解速率也高于对照组。在网袋埋入后第10 d，对照组与施菌组棉花秸秆降解速率差距不大，施菌组和对照组棉花秸秆的坚韧度也没有明显变化，但在施菌组秸秆表面可观察到白色丝状菌落（图3a）。第一次取样以后棉花秸秆降解速率在两个处理之间的差距开始逐渐增大，施菌组处理的棉花秸秆降解速率开始大于对照组。在整个降解周期前20 d秸秆降解速率在整个降解实验过程中最大，对照组平均可达到 0.97 g ∙ d−1，施菌组为 0.93 g ∙ d−1，20 d以后降解速率开始逐渐减小；降解第30 d降解速率又开始增大但小于10 — 20 d阶段，此阶段施菌组秸秆表皮已部分脱落，纤维质松散，菌丝开始包裹秸秆木质部，很容易沿秸秆柱状中轴掰开，对照组棉秆表皮仍比较坚硬，不容易弯折（图3b）；最后10 d对照组和施菌组降解速率均下降，是整个降解实验过程中最慢的一个阶段，平均降解速率均为 0.13 g ∙ d−1。

图2 大田试验棉秆降解率Fig.2 Cotton stalk degradation percentage of field experiment

图3 大田降解试验第10天（a）和第30天（b）样品表征Fig.3 Characteristics of field experiment sample be degraded 10 days (a) and 30 days (b)

3 结论与讨论

棉花秸秆还田具有培肥地力等优势，但秸秆不能充分腐解会影响播种质量、出苗、作物生长和产量。棉花秸秆主要是由纤维素、半纤维素及木质素构成，微生物对其降解过程错综复杂，大部分微生物只能降解其中之一，甚至仅限于某一反应过程，单一的微生物由于不能分泌必须的酶系统，很难达到对棉花秸秆的快速降解，而复合菌群的降解能力往往要高于单一菌种，因此需要多种不同降解功能的微生物混合协同作用来完成棉花秸秆的降解。目前获得混合菌种复合菌系主要有两种方法，第一种是直接筛选复合菌剂，在不破坏自然界微生物间协同关系的前提下通过优势组合筛选得到高效而稳定的降解复合菌群；第二种是选取一些功能菌株进行组合，即对已分离的各种功能菌株按照功能进行组合培养，从而得到比单一菌株降解效果更好的菌种组合（付丽丽，2012）。郭夏丽等（2010）以秸秆为唯一碳源，通过菌系组配，得到了一个来源于森林土、竹林土和腐烂秸秆的驯化系组合，其秸秆降解率为38.3%；进一步将驯化系组合与单菌株组合复配并限制性继代培养，得到的秸秆降解复合菌剂在14天内秸秆降解率达到45.7%。本研究采取第二种方式，选取对棉花秸秆中木质素和纤维素有很好降解效果的白腐真菌和嗜热性侧孢霉单一菌种混合复配。这两种单一菌种的降解效果优于市面出售的效果较好的秸秆降解微生物制剂，其中白腐真菌对棉花秸秆木质素降解速率比较快，在为期43 d的降解周期内木质素降解率为14.74%；噬热性侧孢霉对棉花秸秆纤维素的降解特点是在22 d之内纤维素含量明显下将，同时降解速率开始减慢，在为期43 d降解周期内纤维素降解率为17.46%（韩雅娇等，2014b）。微生物之间通过协同作用可以降解棉花秸秆，但微生物之间有拮抗作用则会影响其降解功能，本研究通过拮抗培养试验，发现白腐真菌和噬热性侧孢霉两种菌株共存时不相互抑制菌丝生长，菌株之间没有发生拮抗反应，可以对两种菌株进行复配形成棉花秸秆降解菌群。

为了加速棉花秸秆还田后的降解过程，要尽量控制各种对棉花秸秆降解过程有影响的物理、化学和生物等因素，它们影响到微生物活动的程度，从而影响棉花秸秆降解的快慢与降解程度。温度、氮素含量、含水率和降解微生物菌群类型等因素的优化控制是棉花秸秆降解的关键，可以提高秸秆降解效率，缩短降解时间，增强降解程度。本实验主要研究不同培养温度、不同氮添加量、不同料水比及不同微生物菌群对棉花秸秆木质素、纤维素和酸性洗涤纤维的最优降解条件。温度是影响微生物活动和秸秆降解过程的重要因素，温度过高或过低都会影响微生物对秸秆的降解，本研究中，38℃处理下棉花秸秆降解后木质素含量最低，平均为29.09%，纤维素在45℃降解最彻底，平均含量34.17%，而酸性洗涤纤维在三个温度处理下降解情况则差异不大，含量均在63.30%左右。氮是组成生物体的基本元素，在微生物和植物生长过程中起不可代替的作用，氮素对土壤微生物的影响有正效应、负效应或者效应不显著（Scheu and Schaefer，1998），当棉花秸秆不能及时降解时，如果土壤中氮素不足，则会出现微生物与作物争夺氮素的现象，会进一步导致秸秆降解缓慢和作物生长不良。本实验中，随着氮素添加量增加，木质素降解率也呈现出增加趋势，降解后木质素含量为26.25% — 24.85%，但不同氮素梯度处理之间的差异并不显著；纤维素降解率则随着氮素含量增加而减少，在3%和10%氮添加量处理下含量分别为31.40%和39.60%。通常情况下，复合菌剂相比单一菌剂对棉花秸秆的降解效果要好，噬热性侧孢霉比白腐真菌达到指数生长的时间更短，可率先降解棉花秸秆表皮部分的韧皮纤维，从而增大白腐真菌与内部的接触表面积，提高白腐真菌降解木质素的效率。复合菌剂与单一的白腐真菌和噬热性侧孢霉相比提高了棉花秸秆的降解率，复合菌剂处理下木质素、纤维素和酸性洗涤纤维含量分别达到24.75%、35.11%和62.10%。土壤水分动态变化会导致土壤微生物群落结构和功能发生改变，通常认为长时间干旱会限制微生物生物量和微生物活性。本实验中当料水比为0.5时纤维素含量与酸性洗涤纤维降解率均为最高，含量分别为34.17%和62.61%，木质素在料水比为0.33时含量最低。综合考虑影响棉花秸秆降解的这些环境因素，本实验最终选取降解棉花秸秆的室内最优条件组合为温度45℃、氮添加量3%、料水比1∶2，复合菌剂。此组合中温度略高，在实际应用中达到此标准有一定的困难，但是在4个影响因素中，温度对棉花秸秆降解效果影响最小，并且白腐真菌和噬热性侧孢霉两种菌株生存温度广泛，在室温下均可生存（Maheshwari et al，2000），所以在大田试验中氮添加量和料水比以此结果作为依据。

田间降解试验进一步验证了室内降解实验结果的可靠性，结果表明适量施加氮素、合理灌溉以及施加复配微生物菌剂可提高棉花秸秆还田后的降解率。为期50 d的大田棉花秸秆降解试验结果表明施用复配菌组处理比对照组棉花秸秆降解率提高了3.50%，降解50 d后降解速率趋于平缓，棉花秸秆降解率比室内模拟培养试验低并且降解速率慢。这可能主要与试验地区12月份气温下降和试验期间经历了降雪天气有关，试验后期地表温度已经接近0℃，普通微生物在4℃时会进入休眠状态，过低的温度影响了棉花秸秆降解效果。如果该试验布设在长江中下游以及黄河中下游棉区，降解效果应该会更好，针对西北内陆棉区，可以考虑施菌时间改变为每年3 — 4月春耕时期，可以保证菌种生长所需温度，并且雪融化后土壤湿度较大，随着温度升高，菌剂降解周期可以有效延长。杨小丽（2009）研究表明磷素添加对秸秆降解的影响也较大，在 2 — 12 g ∙ kg−1磷素添加量范围内，磷添加量越大越有利于秸秆降解，因此后续实验需要在考虑实际土壤磷素含量情况下，确定适合于棉花秸秆降解的磷素补充量来促进棉花秸秆在田间快速降解。