消旋酶法DL-丙氨酸的遗传毒性研究

王 岩 吴同俊 滕晶晶 杨同金 冯学庆 夏 新

丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是人体的非必需氨基酸，在生理过程中发挥重要的作用，与丙酮酸相互转化，参与机体葡萄糖循环过程。丙氨酸分为α-丙氨酸/L-丙氨酸，DL-丙氨酸是α-丙氨酸的外消旋体，由等量的左旋体和右旋体构成，无旋光性[1]，为白色透明晶体状颗粒，无臭无味，鲜味良好，通常作为营养增补剂、调味料应用于食品工业中[2]，即可单独作为甜味剂来增强化学调味料的调味效果，也可与谷氨酸钠等制成复合调味品，在医药工业上是生产维生素B6和合成氨基丙醇的主要原料。目前，DL-丙氨酸生产工艺主要有化学合成法、直接发酵法及消旋酶法[3-5]。消旋酶法是以L-丙氨酸为原料的酶催化反应，提取工艺简单，反应速度快，产品收率高，具有良好的应用前景。本研究依据食品安全国家标准(GB15193-2014)[6-8]，拟采用小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠精原细胞染色体畸变实验和细菌回复突变实验对消旋酶法DL-丙氨酸的遗传毒性进行初步评价，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试物 消旋酶法DL-丙氨酸(安徽华恒生物公司，AA0415042303)，纯度≥99.0%。实验时，消旋酶法DL-丙氨酸经充分研磨成粉末后用纯水配制成10 000、5 000和2 500 mg/kg。

1.1.2 主要试剂 大鼠肝脏微粒体酶S9(齐氏生物公司，20160406)、Dexon(敌克松)(Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，40709)、叠氮钠(Sigma公司，04202DJ)、2-AF(Sigma-Aldrich公司，00405JD)、1,8-二羟蒽醌(TCI公司，FHF01-LTMJ)、2-氨基蒽(TCI公司，7GCCI-P0)。环磷酰胺(Alfa Aesar公司，K06R045)、秋水仙素(国药集团化学试剂有限公司，20140423)

1.1.3 实验动物 SPF级昆明小鼠80只(安徽医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：34000200000776和34000200000825，SPF级动物使用许可证编号：SYXK(皖)2013-006)，体质量25～35 g，周龄7～12周，温度20～25℃，湿度40%～70%。所有动物实验前适应性饲养至少3 d，自由饮水、摄食(灌胃前受试动物隔夜禁食)。

1.1.4 实验用菌 鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535(Molecular Toxicology公司)，正式实验前经生物学鉴定特性符合实验要求。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓细胞微核实验 选取50只昆明小鼠，雌雄各半，按性别采用随机数字法随机分5组，每组10只。依据食品安全国家标准(GB15193.5-2014)[6]设消旋酶法DL-丙氨酸10 000、5 000和2 500 mg/kg 3个剂量组、阴性对照组(纯水)和环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg，一次性腹腔注射给药)。间隔24 h 2次经口灌胃染毒，在第2次给药6 h后，取胸骨骨髓制片，每只动物计数2 000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte,PCE)，计数有微核的PCE并计算微核细胞率(微核细胞率=微核细胞数/PCE数×1000‰)。

1.2.2 小鼠精原细胞染色体畸变实验 选取30只雄性昆明小鼠，采用随机数字法随机分6组，每组5只。依据食品安全国家标准(GB15193.8-2014)[7]设消旋酶法DL-丙氨酸10 000、5 000和2 500 mg/kg 3个剂量组、阴性对照组(纯水)和环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg，一次性腹腔注射给药)，其中10 000 mg/kg组设24 h组和48 h组。采用经口灌胃一次染毒法，10 000 mg/kg组分别于染毒后24 h和48 h处死各组动物取材，其余各剂量组均在染毒后24 h取样。动物处死前4 h，腹腔注射秋水仙素4 mg/kg，取两侧睾丸，剔除脂肪，1%柠檬酸三钠低渗，甲醇-冰乙酸固定，60%冰乙酸软化后，染色制片。寻找清晰且分散良好的染色体中期分裂相检查，每只动物分析100个中期分裂相，记录染色体数目及结构改变情况，并计算畸变细胞率(畸变细胞率=畸变细胞数/中期分裂相细胞数×100%)。

1.2.3 细菌回复突变实验(Ames实验) 依据食品安全国家标准(GB15193.8-2014)[8]，设空白对照组、溶剂对照组、阳性对照组和5个消旋酶法DL-丙氨酸剂量组。以3.16倍和5倍为组间距，2次实验消旋酶法DL-丙氨酸剂量分别设50、158、500、1 580、5 000 μg/皿和8、40、200、1 000、5 000 μg/皿。在加代谢活化系统(S9混合液)时选用1,8-二羟蒽醌、2-氨基蒽和2-AF做阳性物，不加S9混合液时选用敌克松和叠氮钠做阳性物。实验采用平板掺入法，分别在加和不加S9混合液的条件下进行，每组各做3皿，计数每皿的回变突变菌落数。

2 结果

2.1 小鼠骨髓细胞微核实验结果 消旋酶法DL-丙氨酸10 000 mg/kg、5 000 mg/kg和2 500 mg/kg组PCE微核率与阴性对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 小鼠精原细胞染色体畸变实验结果 消旋酶法DL-丙氨酸10 000 mg/kg、5 000 mg/kg和2 500 mg/kg组动物睾丸精原细胞染色体畸变率、畸变细胞率与阴性对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组小鼠骨髓细胞微核实验结果比较

注：与阴性对照组比较

表2 消旋酶法DL-丙氨酸对小鼠睾丸精原细胞染色体畸变率和畸变细胞率的影响

注：与阴性对照组比较

2.3 Ames实验结果 所有实验平皿菌苔生长良好，无明显可见的沉淀痕迹，对照组每皿回变数均在正常范围，阳性对照组两次测试各菌株的回复突变数均大于对照组的2倍以上。消旋酶法DL-丙氨酸各剂量组及溶剂对照组与空白对照组比较，两次测试各测试菌株的回复突变数均小于对照组2倍，各剂量组之间无剂量-反应关系，测试结果均为阴性。见表3～6。

表3 消旋酶法DL-丙氨酸Ames实验结果(第1次，-S9)个)

表4 消旋酶法DL-丙氨酸Ames实验结果(第1次，+S9)个)

表5 消旋酶法DL-丙氨酸Ames实验结果(第2次，-S9)个)

表6 消旋酶法DL-丙氨酸Ames实验结果(第2次，+S9)个)

3 讨论

甜味剂是能使食物具有甜味的非糖类物质，作为一大类食品添加剂广泛应用于食品工业中，具有品种多、数量大、应用广等特点，但其安全性问题也一直是社会关注的焦点[9]，随着研究的深入，各种甜味剂的毒性效应被发现，长期饮用阿斯巴甜饮料能显著增加患淋巴瘤和白血病危险性[10]，王虹等[11]研究发现甜蜜素和蛋白糖对于小鼠有致突变作用，精子畸形率和骨髓微核率均显著高于对照组。消旋酶法DL-丙氨酸作为一种新型的食品添加剂，不仅可以作为甜味剂，也可用于营养强化剂和调味品，由于其生产工艺简单、设备投资少、三废排放少，使其大规模生产和应用成为可能[12]。

本研究结果表明，各剂量消旋酶法DL-丙氨酸没有对骨髓红细胞造成明显的抑制作用，未见其对小鼠体细胞或生殖细胞具有遗传毒性或致突变作用，且无论是否存在代谢活化系统，消旋酶法DL-丙氨酸对五组组氨酸缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 均未显示出任何致突变作用，前期急性经口毒性实验结果也显示消旋酶法DL-丙氨酸对大、小鼠急性经口LD50雌、雄性均大于10 000 mg/kg，属实际无毒类，可以认为消旋酶法DL-丙氨酸作为一种食品添加剂是基本安全的，与国内研究[13]基本一致。陈耿等[14]对发酵法L-丙氨酸进行了90天经口毒性实验发现雌、雄大鼠实际摄入的最大未观察到有害作用剂量分别为5.56、4.58 g /kg ( 分别相当于推荐剂量的332 和274 倍) ，对于消旋酶法DL-丙氨酸厂家提供的成人推荐剂量(1.0 g/d)长期使用是否安全还需进行亚急性、亚慢性毒性实验以进一步评估其安全性。