采收期对费约果活性氧代谢及AsA—GSH循环的影响

陆云梅 黄仁华

摘要：为了阐明采收期对费约果贮藏期间活性氧代谢的影响，确定果实最佳采收时期，以品种Coolidge果实为材料，分析了始熟期（花后130 d）、盛熟期（花后150 d）和过熟期（花后170 d）采收果实在贮藏期间果肉线粒体细胞活性氧代谢及抗坏血酸—谷胱甘肽（AsA-GSH）循环的差异。结果显示，盛熟期采收的果实在贮藏后期H2O2含量和O2-·产生速率显著高于始熟期和过熟期采收的果实，而贮藏前6 d无显著差异；同时，果实在贮藏前期，抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）等酶活性以及抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量变化较小，但9 d后呈迅速增加的变化趋势，其中DHAR、GR活性以及AsA和GSH含量增加速率以过熟期采收的果实最大，其次为始熟期和盛熟期。因此，针对果实贮藏期活性氧代谢及AsA-GSH循环而言，采收时间对费约果短期贮藏无显著影响，而中长期贮藏以盛熟期（花后150 d）采收为最佳时期。

关键词：采收期；费约果；线粒体；活性氧代谢；AsA-GSH循环

中图分类号：S667.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0050-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.012

Abstract： In order to elucidate the effects of harvest time on active oxygen metabolism of Feijoa sellowiana fruit during storage and determine the best harvest time，the active oxygen metabolism and AsA-GSH cycle in mitochondria of Feijoa sellowiana pulp harvested at initial ripe stage （IRS，130 d after flowering），full ripe stage （FRS，150 d after flowering） and excess ripe stage（ERS，170 d after flowering） were studied during the storage. The results showed that the H2O2 content and O2-· production rate in FRS fruits was significantly higher than those in IRS and ERS fruits during the late storage stage，but there were no significant difference before 6 d storage. At the same time，there were no significant changes in APX，DHAR，GR activities and AsA and GSH contents during the early stage of postharvest storage. After storage 9 d，the rapidly increasing trend in these indexes were showed and the biggest increasing rate was found in ERS fruits，followed by ERS fruits and FRS frruits. Therefore，in the case of active oxygen metabolism and AsA-GSH cycle during the fruit storage period，harvesting time had no significant difference on the F. sellowiana fruits in short-term storage，but for long-term storage，the full ripe stage（150 d after anthesis） was optimal harvesting time.

Key words： harvesting time； Feijoa sellowiana； mitochondria； active oxygen metabolism； AsA-GSH cycle

費约果（Feijoa sellowiana Berg.）又名肥吉果、菲油果、南美稔、凤榴，系桃金娘科，属常绿灌木或小乔木[1]，起源于巴西最南端、阿根廷北部、巴拉圭和乌拉圭西部的山区。目前，新西兰、法国、西班牙、葡萄牙、意大利、日本等国均有专门果园种植，其中新西兰是种植发展最好的国家，在中国，西南科技大学生命科学与工程学院于2004年从新西兰将其引入四川绵阳地区，经过近十年的驯化引种，已逐步进入推广种植阶段[2]。费约果果实芳香，具有人体需要的多种营养成分，如矿质元素、脂肪酸、维生素、多酚、类胡萝卜素等[3-5]，是目前国际市场热销的新型水果之一。

经过近十几年的引种栽培发现，费约果存在果实成熟期不一致的问题，同一品种从始熟期到过熟期可达40 d左右。在新西兰对费约果的采收大多采用自然掉落的方式，很大程度上影响了果实的上市时间和货架期[1]。适宜的采收期对保持果实良好的风味品质以及延长贮藏时间具有重要的意义，采收过早，尚未形成品种固有的品质和风味，且耐藏性和抗病性差；采收过迟，果肉风味变淡，采后果实易衰老、不耐贮运[6]。目前关于果实在贮藏期间衰老的机理研究主要集中于乙烯对果实成熟衰老的调控[7]，细胞壁多糖的降解[8，9]、呼吸速率的变化[10，11]等方面，而对果实贮藏期衰老过程中线粒体细胞活性氧代谢机制的研究较少。为此，试验针对不同采收期对费约果货架期的影响，研究了不同采收期对费约果贮藏过程中果肉线粒体细胞活性氧代谢及AsA-GSH循环的差异，以期为费约果的合理采收以及衰老机理提供新的认识，进而为完善果实采后贮藏技术体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

费约果果实采自西南科技大学西山校区费约果栽培园Coolidge品种，该品种于2004年从新西兰引进，栽培表现良好。2016年于果实始熟期（花后130 d）、盛熟期（150 d）和过熟期（花170 d）分别进行采摘，采摘时选择树体东、南、西、北4个方向高度基本一致，果形端正、无病虫害、大小均匀的果实，每次采摘60个果实运回实验室并用2%的次氯酸钠消毒处理，2 min后用去离子水洗净，风干，用黑色聚乙烯塑料袋包装进行贮藏，分别在果实贮藏0、3、6、9、12和15 d取样测定。

1.2 线粒体的制备

随机取10枚果实取果肉50 g，用100 mL提取液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，内含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1% BSA、0.5% PVP、0.1% 半胱氨酸）在4 ℃研磨，用4层纱布过滤，滤液在4 ℃下 6 137 r/min离心10 min， 以后的离心和洗涤步骤参照Van Emmerik等[12]的方法，取上清液在4 ℃下11 481 r/min离心分离20 min；将沉淀用20 mL洗涤液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，内含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1%BSA）洗涤，4 ℃下11 481 r/min离心分离20 min，再取上清液离心分离，得到的沉淀即为线粒体，用1.5 mL悬浮液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，内含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA）悬浮，线粒体内蛋白质含量用牛血清蛋白标定法测定。

1.3 测定方法

采用林植芳等[13]的方法测定过氧化氢（H2O2）含量，并依据王爱国等[14]的方法测定超氧阴离子自由基（O2-·）產生速率。抗坏血酸（AsA）和脱氢抗坏血酸（DHAsA）含量测定参考Arakawa等[15]和Nakagawara等[16]的方法；还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量测定参考Castillo等[17]的方法；单脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定参考Shigeoka等[18]的方法，以1 min内OD340 nm变化0.01个单位定义为1个酶活性单位；谷胱甘肽还原酶（GR）活性的测定参考Smith等[19]的方法，以1 min内每克鲜样OD340 nm变化0.01个单位定义为1个酶活性单位。以上测定均重复3次。

1.4 数据分析

试验数据采用SAS 8.1 ANOVA过程作差异显著性检验，并用LSD法作多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 采收期对费约果贮藏期间线粒体细胞H2O2含量和O2-·产生速率的影响

从图1可以看出，3种不同采收期费约果果肉线粒体细胞H2O2含量的变化在贮藏前6 d差异不明显，均表现为缓慢增加，说明费约果离开树体短期内H2O2代谢相对稳定；贮藏9 d后，3种采收期果肉线粒体细胞H2O2含量均出现迅速上升的变化趋势，且过熟期和始熟期采收果实H2O2含量增加的速率显著高于盛熟期，说明过早和过晚采收费约果均会引起果实贮藏后期H2O2含量的紊乱。

与果肉线粒体细胞H2O2含量的变化相似，O2-·产生速率在果实贮藏前6 d也呈缓慢增加的过程，且3种不同采收期果实在贮藏0、3和6 d时O2-·产生速率均无显著差异（图2）。贮藏第9天，盛熟期采收的果实O2-·产生速率为0.20 μmol/（min·mg protein），并显著高于始熟期和过熟期采收的果实；而贮藏最后6 d，过熟期采收的果实O2-·产生速率显著高于始熟期和盛熟期采收的果实，说明过熟期采收的果实经过长期贮藏可能会引起O2-·代谢紊乱，导致费约果腐烂，失去商品价值。

2.2 采收期对费约果贮藏期间线粒体细胞AsA-GSH循环酶活性的影响

图3反映了不同采收期对费约果贮藏期间果肉线粒体细胞APX活性的影响。果实采收时，3种采收期采收的果实APX活性差异不显著。在整个贮藏过程中，过熟期采收的果实APX活性变化比较平缓，至贮藏结束时APX较采收时仅仅增加了0.76 U/mg protein，而盛熟期和始熟期采收的果实APX活性在贮藏前9 d变化相对缓慢，9 d后呈迅速增加的变化趋势，至贮藏结束时APX活性较采收时分别增加了3.49和1.46 U/mg protein。

从图4可以看出，不同采收期采收的费约果果肉线粒体细胞GR活性在整个贮藏过程中均呈上升的变化趋势。过熟期采收的果实GR活性随着贮藏时间的延长增加速率明显高于始熟期和盛熟期采收的果实，至贮藏结束时其活性达到了5.39 U/mg protein，相当于采收时的8.90倍；始熟期采收的果实在前9 d变化较小，之后3 d活性变化最大，至贮藏结束时活性较采收时增加了2.84 U/mg protein；盛熟期采收的果实GR活性在整个贮藏期间变化比较平缓，未出现急剧变化过程。

由图5可见，不同采收期采收的费约果果肉线粒体细胞DHAR活性在贮藏前6 d基本没有变化，6～12 d不断增加，之后迅速下降。始熟期和过熟期采收的果实DHAR活性变化趋势一致，在贮藏12 d时出现最大值，活性分别为3.02和2.77 U/mg protein，显著高于其他贮藏期；除贮藏第9天外，盛熟期采收的果实DHAR活性在整个贮藏过程中均显著低于始熟期和过熟期采收的果实。

2.3 采收期对费约果贮藏期间线粒体细胞抗坏血酸和谷胱甘肽含量的影响

不同采收期费约果在贮藏过程中果肉线粒体AsA和DHAsA含量及比值的变化见表1。从表1可以看出，始熟期采收的果实果肉线粒体AsA含量在果实采收时（贮藏0 d）极显著高于盛熟期和过熟期采收的果实。在贮藏前6 d，始熟期和过熟期采收的果实果肉线粒体AsA和DHAsA含量均呈上升趋势，而在贮藏第9 d，AsA含量出现了下降，之后又持续上升直至贮藏15 d出现最大值，其最大含量分别为1.49和1.93 μmol/mg protein；除贮藏9 d外，盛熟期采收的果实AsA和DHAsA含量在整个贮藏过程中均低于始熟期和过熟期采收的果实，最大值也出现在贮藏末期（15 d），其含量为1.05 μmol/mg protein。随着贮藏时间的延长，3种不同时期采收的果实AsA与DHAsA的比值均逐渐下降，至贮藏结束时，盛熟期采收的果实果肉线粒体AsA/DHAsA值明显高于始熟期和过熟期采收的果实，说明盛熟期采收的果实在贮藏期间能更好地维持AsA和DHAsA的平衡。

从表2可以看出，不同采收期果实在采收时果肉线粒体GSH含量差异较大，其中盛熟期果实采收时GSH含量最低，相当于始熟期和过熟期采收果实的64.87%和74.48%，而在整个贮藏过程中，除贮藏9 d外，盛熟期采收果实的GSH含量也均极显著低于另两个时期采收的果实；从表2还可以看出，3种时期采收的果实GSH和GSSG含量总体均呈上升趋势，其中贮藏前6 d，GSH含量变化平缓，而贮藏6 d后果实GSH和GSSG含量变化比较迅速，尤其是始熟期和过熟期采收的果实，至贮藏末期GSH含量分别是采收时的2.90和4.54倍；另外，随着贮藏时间的延长，GSH/GSSG值也呈不断下降的趋势，至贮藏末期3种采收期下的果实果肉线粒体GSH/GSSG值分别为采收时的46.62%、72.18%和42.25%。

3 小结与讨论

果实在贮藏过程中，细胞内活性氧自由基的积累会不断增加而使膜脂质过氧化作用加强，破坏机体组织结构，导致果实腐烂[20]。适宜的采收期对维持果实商品性和货架期至关重要，果实贮藏期间，胞内产生过量的H2O2，在正常情况下可通过Halliwell-Asada途径清除，果实采收过早或过晚均会影响 Halliwell-Asada途径中关键酶（APX、GR以及DHAR等）和底物（AsA和GSH）的运转，从而破坏活性氧代谢平衡[21]。试验中对费约果分3个成熟期进行采收，结果显示，不同采收期果肉线粒体细胞H2O2含量和O2-·产生速率在贮藏前6 d变化不显著，说明采收期在费约果短期贮藏期间对活性氧代谢影响不大；但是果实贮藏9 d后，果肉线粒体细胞H2O2含量和O2-·产生速率均出现迅速上升的变化趋势，且过熟期和始熟期采收果实上升的速率极显著高于盛熟期，说明过早和过晚采收费约果均可能会引起果实贮藏后期活性氧代谢的紊乱，不利于长期贮藏。

在AsA-GSH循环中，DHAR、APX以及GR在AsA和GSH参与的信号转导途径中起关键作用，其中DHAR可以催化AsA的再生，试验中DHAR活性在果实贮藏前12 d不断增加，这可能是为适应体内活性氧积累的一种适应性调节，有利于AsA的再生。过熟期和始熟期采收果实在贮藏期间DHAR活性均极显著高于盛熟期采收的果实，一方面可能与过熟期和始熟期果实采收时DHAR活性较高有关，另一方面可能是由于这两个时期采收的果实贮藏期间活性氧产生速率过高，刺激了DHAR活性；大量研究表明，APX活性直接影响到AsA的含量，在AsA-GSH 循环代谢中，APX被认为是植物细胞中有效分解H2O2的重要酶之一，APX 活性的增加有助于果实耐贮性的提高[22]，试验结果显示，盛熟期采收的果实果肉线粒体细胞APX活性在贮藏后期迅速增加，其活性增加速率极显著高于始熟期和过熟期，由此可推测盛果期采收的费约果果实较始熟期和过熟期更耐贮藏。

GR是普遍存在于动植物细胞中的抗氧化诱导酶，对清除活性氧起积极作用，当活性氧的含量危及到GR的活性时，植物就会受到伤害。试验结果表明，果实在贮藏前期GR的活性比较稳定，而贮藏后期迅速增加，笔者认为贮藏后期酶活性的增加可能是受到了活性氧的诱导，AsA-GSH循环做出了适应性反应以提高活性氧清除效率；同时试验结果还显示，过熟期采收的果实GR活性在贮藏后期增长速率显著高于始熟期和盛熟期采收的果实，说明过熟期采收的果实在贮藏后期受活性氧破坏的程度更严重，不利于中长期贮藏；另一方面，果实在贮藏过程中，GR可以诱发增加抗氧化剂的合成，如AsA、GSH等，从而限制脂类过氧化，因此通过提高GR的活性可能会增加GSH的积累，试验中GSH的含量变化与GR活性的变化达到极显著正相关（r=0.944 1，P=0.01），也证实了以上观点。

植物AsA-GSH循环系统中的AsA/DHAsA、GSH/GSSG比率反映了细胞内的氧化还原势，而细胞内的氧化还原势决定体内电子流，电子流又在体内的信号转导方面占重要地位，调控ASA、GSH参与信号转导途径，Ziegler[23]认为较高的AsA/DHAsA和GSH/GSSG比率對维持氧化-还原反应顺利进行和AsA在氧化胁迫下再生很有必要。试验结果表明，费约果贮藏过程中果肉线粒体细胞AsA/DHAsA和GSH/GSSG的比率均处于下降的趋势，至贮藏结束时，盛熟期采收的果实果肉线粒体AsA/DHAsA以及GSH/GSSG值显著高于始熟期和过熟期采收的果实，说明费约果果实在盛熟期采收有助于维持AsA-GSH循环系统的平衡，促进AsA再生，但本试验中始熟期和过熟期采收的果实AsA含量在贮藏期间反而高于盛熟期采收的果实，可能是由于始熟期和过熟期采收的果实在贮藏期间活性氧的大量积累刺激了AsA合成，使机体组织中AsA和DHAsA总量得到了增加，其合成机理有待进一步研究。

从费约果果实贮藏期间果肉线粒体细胞活性氧代谢来看，盛果期（花后150 d左右）采收有利于维持果实贮藏期间活性氧代谢平衡，而采收过早或过晚活性氧产生速率均明显提高，不利于果实中长期贮藏；同时，盛熟期采收的果实果肉线粒体细胞中在维持AsA-GHS循环平衡方面也显著高于始熟期和过熟期采收的果实，保证了Halliwell-Asada途径在清除活性氧方面底物和关键酶高效运转，有利于果实中长期贮藏。

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