基因特异性分子标记在植物育种中的研究进展

张丹丹 周延清 杨珂

摘要：基因特异性分子标记是基于基因序列中功能性单核苷酸多态性（SNP）或插入和缺失（InDels）位点开发而成，具有选择效率高、共显性、与目标基因共分离、不受遗传背景影响等优点，且与生物表型性状高度相关，在生物表型性状的鉴定中更突显出其准确性和直接性，可以准确地跟踪、定位不同遗传背景下的目标等位基因，是农作物分子标记辅助选择育种中理想的分子标记类型。对基因特异性分子标记的原理、开发及在植物育种的应用进行论述，并探讨了基因特异性分子标记的发展趋势，以期为分子标记辅助育种提供参考依据。

关键词：SNP；InDel；PCR检测；分子标记辅助育种；基因特异性分子标记

中图分类号：Q341 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0005-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.001

Abstract： Gene-specific molecular markers are directly developed from functional SNPs or InDels of the gene itself. It has several advantages such as high selective efficiency， co-dominant， co-separate with the target gene， unaffected by genetic background， high correlation to trait， accuration and directness， exactly track and location of target alleles gene under different genetic background， which is an ideal molecular marker for crop marker-assisted selection breeding. The present review concerned the advances on the principle， development， application and development trend of gene-specific molecular markers， which will provide reference to the molecular assisted breeding.

Key words： SNP；InDel；PCR detection；molecular marker-assisted breeding；gene-specific markers

分子标记（Molecular marker）是以生物大分子的多态性为基础而发展起来的一种遗传标记。可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质被称为广义的分子标记，而DNA分子标记被称为狭义的分子标记[1]。DNA分子标记能够直接反映DNA分子水平上的差异，具有稳定性、成本低廉和使用简便等优点，已应用于基因组作图、基因定位、遗传多样性评价、系统进化分析和法医研究[2]、图位克隆、功能基因组学研究、转基因植物鉴定与分子标记辅助选择育种等方面[3，4]。

基因特异性标记是基于目标基因内部DNA序列多态性开发的标记，与目标基因共分离，不受遗传背景影响，与生物表型性状高度相关，在生物表型性状的鉴定中更突显出其准确性和直接性，将成为生物分子标记辅助选择育种中理想的分子标记类型[5]，已在水稻和小麦抗病基因[6-8]、油菜脂肪酸代谢基因[9，10]得到应用。随着现代生物技术的发展，高通量测序技术逐步发展和完善，功能性分子标记提高生物品种改良效率的作用和优点越来越凸显出来，其开发与应用必将越来越多。本研究从原理、开发及在植物育种的应用对基因特异性分子标记的研究进展进行概述，以期为该方面的研究提供参考。

1 基因特异性分子标记的原理和特点

基因特异性分子标记是从目标功能基因序列中功能性SNP（单核苷酸多态性）位点或InDels（碱基的插入-缺失）开发有效的功能标记。由于基因特异性分子标记是涉及表型性状变异的功能基因内部多态性位点的开发，与随机DNA分子标记相比，分子标记辅助育种具有以下优势：①能准确跟踪、定位功能等位基因，在作物表型性状的鉴定中更具准确性；②高效率地筛选出育种所需的有利基因；③将影响相同或不同性状的等位基因特异性分子标记组合，用于分子设计育种；④由于是直接来自基因位点上决定功能的多态性基序，一旦基因特异性分子标记被开发出来，可直接应用于人工育种群体和自然群体中。

2 基因特异性分子标记的开发

明确与作物表型性状紧密相关的功能基因，并将其成功分离、克隆是基因特异性分子标记开发的首要条件。功能基因可以从公共数据库、相关文献或通过重测序获得，将获得的功能基因和等位基因进行序列比对，寻找功能基因内部的特定区域的SNP、InDel等多态性基序，开发出鉴定该功能基因特异SNP或InDel位点的分子标记。

2.1 基于SNP的基因特异性分子标记的开发

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）主要是指由于單个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。SNP位点在基因内区域分布较多，有的功能SNP位点的改变，会引起基因碱基序列的改变，进而造成其所翻译的蛋白质序列发生变化，对蛋白质的功能产生影响，从而引起生物性状的改变，利用引起该变异的SNP位点设计功能基因特异性分子标记。然后，可以对试验材料进行快速筛选，分析具有目标基因的材料，对分子标记辅助育种奠定基础。如在作物抗性育种过程中，同一个抗性位点可能存在多个抗谱，多个不同的功能性等位基因，它们在序列上高度相似，对抗病等位基因进行序列比对，寻找各基因特异的SNP位点，设计特异性引物对该SNP位点特异性扩增，对抗性等位基因准确筛选，能提高植物抗性育种的精确性和效率。如水稻抗瘟病基因Pi9[11，12]、Pi35[13]、Piz-t[14]等，开发出了其特异性分子标记，对利用抗病基因培育水稻优良抗病品种提供重要依据。

SNP分子标记具有多态性丰富，在作物基因组中分布密度大、富有代表性、检测速度快等特点[15]，但SNP的高检测成本曾一度限制其在农作物育种中的使用，随着高通量测序技术的发展，大量基因组序列的开发，为科研工作者提供了众多物种的基因组序列信息，用基于PCR的方法对SNP进行检测，使其变为简单而高效的分子标记。

2.1.1 将SNP标记转化为CAPS或dCAPS标记 酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）技术和衍生酶切扩增多态性（Derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS）技术是基于PCR扩增与酶切反应相结合的方法，即利用能够区分识别目标SNP位点序列的某种限制性内切酶，对不同SNP区段的PCR片段进行酶切并电泳分型[16，17]。CAPS和dCAPs分子标记具有以下优点：①通常基于已知的基因；②仅需少量的DNA；③共显性，仅用PCR和琼脂糖凝胶电泳就能鉴定纯合基因型和杂合基因型；其中最大的优势是基于候选基因特征的基因型CAPS/dCAPS多态性，提高了育种程序中遗传作图和可靠分子标记应用的能力[18，19]。

通过对相关等位基因进行BLAST比对，获得目的基因特异的SNP，若SNP位于限制性内切酶位点上，选择合适的内切酶酶切PCR产物，通过对酶切片段分析建立与目标基因紧密连锁的共显性CAPS标记；若SNP所处的位置不是限制性内切酶识别位点，在该SNP位点的上游或下游设计引物时，引进错配碱基以构成一个可以被限制性内切酶识别的位点，通过酶切片段的差异来获得目的基因的特异性分子标记。王彩芬等[20]以水稻耐盐基因SKC1基因的SNP突变体为材料，分析SNP突变位点前后的限制性酶切位点，建立了SKC1突变位点的CAPS标记，可用于耐盐分子标记辅助选择育种。华丽霞等[12]通过对抗稻瘟基因Pi9及其他在Pi2/9位点上鉴定到的抗性基因进行序列比对，在Pi9的第一内含子处存在一个特异SNP，在该SNP上游作为正向引物的3′末端引入一个错配碱基G，将其转化为dCAPS分子标记，所开发的Pi9特异性分子标记Pi9SNP可以将Pi9与定位于该位点上的其他抗性基因进行区分。

2.1.2 等位基因特异PCR（AS-PCR）策略 同CAPS和dCAPS标记一样，用等位基因特异PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）检测的SNP标记也是共显性标记，不同之处在于AS-PCR使用的是自然错配碱基，通过扩增不能产生PCR产物。通过对等位基因BLAST比对，来获得目的基因的特异SNP位点，设计的特异性引物的3′末端和SNP位点对应的等位碱基完全匹配，需要在3′末端不同位置引入错配碱基，若样品中的SNP位点与特异性引物的3′末端相匹配，便能进行有效PCR扩增，反之则不能进行有效的PCR扩增，通过扩增条带的有无来检测目的基因。徐薪惟等[21]通过对I-2基因及其他等位基因进行序列比对，在I-2特异的SNP置于引物3′端，并在特异引物的3′端引入C-T碱基错配的引物，退火温度在58 ℃能根据扩增条带的有无和片段大小，将I-2基因的突变位点和感病品種区分开，为番茄抗枯萎病辅助育种提供有力工具。等位基因特异PCR法（AS-PCR）通过巧妙设计特异引物，仅通过PCR反应就能将不同的SNP基因型分开，具有程序简单、易于操作等优点，可用于分子标记辅助育种，但该方法由于特异性引物的稳定性较差，对扩增条件要求比较严格，操作繁琐，只适合于小规模SNP的检测。

2.1.3 PCR-CTPP方法 两对交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）方法是根据SNP位点不同的基因型设计2对不同的引物，经一次PCR扩增反应后进行琼脂糖凝胶电泳，分析SNP等位基因的方法。PCR-CTPP方法的巧妙之处在于2对引物的设计，引物3′端碱基是引发延伸的起点，具有较高的稳定性，设计合理的错配类型及在合适的位置引入人为错配发生碱基错配，在合适的PCR条件下，扩增效率较低，而正确的配对则可以使PCR扩增顺利进行。通过设计的4条引物并利用待测品种基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增条带类型鉴定基因型。如抗稻瘟病基因Pi25[22]和Pi35[13]，通过改进的PCR-CTPP方法开发出了鉴定该功能基因的特异SNP位点的分子标记，利用该标记可快速鉴定水稻种质资源的基因型和进行分子标记辅助育种。PCR-CTPP方法具有快速简单、成本低廉等优点，但是由于将2对引物放入同一个PCR体系中，可能存在复杂的相互作用，因此2对引物Tm值的设计、合理的错配类型及错配碱基的引入位置[23]都能提高PCR-CTPP的成功率。另外，改进的PCR-CTPP法如两步法PCR-CTPP[24]、OPA-CTPP[25]的应用，使得PCR-CTPP技术有着更广阔的应用前景。

2.2 基于InDel的基因特异性分子标记的开发

功能基因序列中碱基的插入、缺失会对基因的转录激活活性产生一定影响，从而影响植物的性状[26]。InDel标记可通过片段长度差异直接检测，是共显性分子标记。基于InDel的基因特异性分子标记的开发是将等位基因BLAST比对后，查找筛选出特异的InDel位点，针对InDel位点来设计特异引物，进行PCR扩增，根据扩增产物片段的大小区分等位基因，从而获得目的基因的InDel标记。聂京涛等[27]通过图位克隆的方法获得黄瓜白粉病抗性基因Mlo，并通过测序发现第11外显子上的1 449 bp片段的插入/缺失，根据此插入/缺失突变设计InDel标记，对设计的3对特异性引物进行PCR扩增，产物差异较大，可以清晰区分抗、感亲本，该InDel标记适合大多数黄瓜材料的白粉病抗性鉴定和分子标记辅助育种。

InDel标记本质上属于长度多态性遗传标记，可基于PCR扩增技术对InDel进行检测。因此，用电泳平台即可分型，相对于SNP标记操作更加简单方便，电泳分型平台有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管电泳。InDel长度变化较大，应选择多态性差异5～20 bp的InDel，这类InDel设计的成功率较高，并且便于检测[28]。作为分布密度较广的SNP和InDel标记，它们的分布不均匀，位置有一定互补性，可以根据目的基因的位置设计不同的分子标记[29]。明确功能基因的SNP和InDel位点，发掘出大量的功能基因，有利于进一步开发优良基因，并应用于分子标记辅助育种中。

3 基因特异性分子标记的应用

3.1 基因特异性分子标记在分子标记辅助育种中的应用

分子标记辅助育种利用与目标基因紧密连锁的分子标记对个体进行优势基因型的筛选，可在任何生长期进行，不受环境条件影响，可排除非等位基因相互作用造成的干扰，具有快速、经济、效率高、准确性高等优点[30]。其中基因特异性分子标记是基于功能基因内部序列多态性开发的，与功能基因共分离，在分子标记辅助育种中更突显出其准确性和直接性。Ramkumar等[6]根据抗稻瘟病基因Pi54的外显子区域中的144 bp插入/缺失的多态性，创建InDel标记——Pi54MAS，可用于水稻分子标记辅助育种中。聂京涛等[27]开发了与黄瓜白粉病抗性主效基因/QTL共分离的3个共显性InDel分子标记，可应用于分子标记辅助育种中；Jin等[31]将茶树TCS1基因的1个SNP4318位点转化成功能性标记dCAPS1，可用于分子标记辅助选择中来提高茶质量。

3.2 基因特异性分子标记在功能基因鉴定、定位及遗传图谱构建中的应用

基因特异性分子标记可以将抗病等位基因进行鉴定和区分，用于抗病农作物品种的培育。利用基因特异性分子标记分布密度大和多态性高的特点，SNP或InDel位点与某些功能基因或QTL间的连锁关系，可将功能基因精细定位和构建遗传图谱。华丽霞等[12]利用SNP-dCAPS标记，将抗稻瘟病基因pi2/pi9/piz-t与该位点上的其他抗性等位基因及感病等位基因分开，这为分子标记辅助育种及抗病基因聚合提供了有效的分子标记；蔡海亚等[14]检测到水稻抗稻瘟病基因piz-t的特異性SNP位点，通过特异性引物对该SNP位点特异性扩增，实现piz-t等位基因的鉴定；张圣平等[32]获得的黄瓜果实苦味（Bt）基因的InDel标记Bt-InDel-1，可用于无苦味黄瓜的分子标记辅助选择育种及Bt基因的精细定位；张成才等[33]将8个茶树品种中检测到的39个SNPs转化为CAPS标记，此标记可以用于茶树遗传多态性检测和茶树遗传图谱构建等方面的研究；Lv等[34]利用InDel标记，将结球甘蓝抗枯萎病基因（FOC）定位于C06染色体上，为分子标记辅助选择甘蓝抗性育种奠定基础。

3.3 基因特异性分子标记在种质资源分析中的应用

新品种的鉴定和筛选是作物育种中的重要环节，将不同种质资源进行分类，可以为种间的遗传差异比较、杂交育种亲本选择等提供参考依据。马建等[8]通过比对水稻抗、感品种中Pi35等位基因序列检测出来的特异SNP，开发出Pi35基因的功能性分子标记pi35-dCAPS，对中国水稻核心种质资源和部分育成品种进行鉴定，以期发掘携带Pi35基因的新品质；Zhou等[35]选定的55个SNP标记和基因分型方法是咖啡种质资源管理的辅助工具。朱东旭等[36]筛选出286个结球甘蓝相对于大白菜的特异InDel标记，并对实验室获得的大白菜-结球甘蓝易位系进行初步鉴定，为大白菜-结球甘蓝易位系的精确鉴定开辟了新途径。郭广君等[37]获得的辣椒2号染色体35个多态性InDel标记可有效区分24份辣椒种质的多样性和特异性，其聚类结果与表型特征吻合。基因特异性分子标记在种质资源的遗传分析、品种区分上有很好的精确性，具有极大的应用价值。

4 展望

分子标记一直在不断发展，不同分子标记各有其优缺点，根据研究目的，科学家可以选择最合适的分子标记。各种分子标记的结合使用可节省标记的开发时间和成本，提高遗传图谱的精度和多态性，加快辅助育种的进度。如基于EST-SNP的CAPS标记的开发[38，39]；如基于RAPD、AFLP标记转化的SCAR标记，提高了标记的稳定性，在辅助育种中更灵活、有效[40-43]。

RFLP、RAPD、AFLP及SSR等随机DNA分子标记是基于基因组中随机多态性位点开发而成，这些分子标记与目标基因的连锁关系常常因基因重组而被破坏，从而影响标记的可靠性[44，45]。而基因特异性分子标记是基于植物表型性状连锁的目标功能基因序列中，特定区域位点上的 SNPs或 InDels开发的[5]，能准确地跟踪、定位群体中的目标等位基因。基因特异性分子标记的开发首先要获得与植物表型性状密切相关的功能基因以及主效功能基因，而大量基因组序列未知，导致InDel和SNP的引物设计与开发存在一定的难度。随着高通量测序技术的迅速发展，大量基因组序列的开发，可利用的国际公共数据库序列信息的日益丰富，使得SNP和InDel标记的开发空间进一步提高。如SNP位点的开发方法有EST数据库、扩增子重测序、全基因组序列、第二代测序技术等[46]；如分离、克隆功能基因的方法有图位克隆[47]、比较基因组学[48]、电子克隆[49]等；如全基因组酶切位点的简化测序技术RAD-seq技术[50]、TILLING和TS-PCR技术的结合[51]，使得SNP标记的开发及应用的效率大大提高；基因的功能鉴定通常能根据相似功能基因之间的序列同源性推测表达序列可能具有的功能；另外，表达谱分析等高通量的检测方法、RNA干扰、定向诱变（TILLING）等也可以用来鉴定基因的功能[52]。如何使更多的功能基因被分离与鉴定，如何开发与功能基因紧密连锁的分子标记，尤其是基因位点特异性标记，对于精准鉴定农作物抗性品种以及培育抗病品种具有重要意义。

随着生物信息学、分子生物学、基因组学、基因芯片等的不断发展与分子标记的相互融合，将出现更具体、更实用、更简单的分子标记，分子标记在植物的研究方面将有更加广阔的前景。

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