高强度间歇运动与中等强度持续运动对小鼠代谢表型及骨骼肌自噬影响的对比研究

王倩 张珊 牛燕媚 傅力

1天津医科大学生理学与病理生理学系（天津 300070）

2天津医科大学康复医学系（天津 300070）

近些年来，高强度间歇运动（high intensity inter⁃val training，HIIT）以其耗时短、强度大、恢复快的特点，逐渐受到运动员和健身爱好者的青睐。HIIT通过快速提高运动者心率、增加身体氧耗，同时制造缺氧状态，使机体在恢复期仍需要更多的氧气，进而消耗额外的热量。也正因如此，针对 HIIT的研究多集中在呼吸、循环系统相关临床表现上，而对机体代谢表型及其相关信号分子通路研究较少。脂联素（Adiponectin，Acrp30）作为脂肪细胞分泌的特异性因子，能够经血液循环作用于机体多个组织细胞的特异性受体，增加细胞葡萄糖摄取和脂肪酸氧化，从而增强细胞胰岛素信号通路敏感性和细胞糖、脂代谢。Acrp30在机体内存在两个特异性受体——脂联素受体1/2（Adiponec⁃tin receptor 1，AdipoR1/2），全长Acrp30蛋白被裂解后释放出的球状域— gAcrp30对骨骼肌高表达的 Adi⁃poR1显示出更高的亲和力[1]。已有大量研究表明，gAcrp30能够增加骨骼肌组织的葡萄糖摄取[2]。HIIT显著的减脂效应使得人们开始揣测其在降低脂肪组织体积的情况下，对诸如 Acrp30等有益脂肪因子的影响。大多数研究显示，HIIT显著减脂的同时，能够增加Acrp30的表达。但也有部分研究结果与其相反[3,4]，其差异可能与HIIT运动方案、受试者基础健康状况以及所检测Acrp30的形式有关。细胞自噬因其广泛参与机体的各种病理生理过程，成为目前生物医学领域研究热点。自噬是为机体提供燃料的生理途径，在 HIIT造成的细胞能量迅速消耗状态下，骨骼肌细胞自噬应对能源物质急速耗竭的反应如何目前尚不清楚。因此，本实验对比中等强度持续运动（moderate intensity continuous training，MICT）与HIIT两种不同运动形式对小鼠体成分、血清gAcrp30水平等代谢表型以及骨骼肌细胞自噬相关蛋白表达的作用，从而为HIIT防治胰岛素抵抗等代谢性疾病提供实验证据。

1 对象与方法

1.1 实验动物分组

4周龄C57BL/6雄性小鼠36只（体重15.00±0.32 g），饲养于天津医科大学实验动物中心，适应性喂养1周后，随机分为安静对照组（Control组）、中等强度持续运动组（Moderate Intensity Continuous Training，MICT组）和高强度间歇运动组（High Intensity Interval Training，HIIT组），每组各12只。均给予12小时光照。均采用正常饮食喂养，饲料为1022配合维持饲料（常规营养成分：水分≤8.0%，粗蛋白≥18.0%，粗纤维≤5.0% ，粗脂肪≥4.0%）。

1.2 运动方案

适应性喂养1周后，运动干预 6周。MICT组为12 m/min（75%VO2max）强度的持续跑台训练，60分/次，1 次/天，5 次/周,共持续 6 周；HIIT 组为 20 m/min（85%VO2max）持续1分钟与8 m/min（50%VO2max）持续1分钟的运动交替进行12个循环，1次/天，5次/周，共持续6周（参照 Fernando等制定的跑速与最大摄氧量对应表）[5]。

1.3 检测方法

1.3.1 体成分检测

各组小鼠在6周运动结束24小时后，应用Impedi-VET进行体成分分析，实验完成后，ImpediVET软件生成综合报告，并进行数据分析，输出体重、体质指数（BMI）、总体液量和脂肪含量等数据。最后将所有小鼠采用颈椎脱臼法处死，采用小动物手术器械分离完整股四头肌，迅速将其放入液氮（－196℃）中速冻，随后转入－80℃冰箱中保存备用。

1.3.2 血清ggAAccrrpp3300检测

各组动物运动结束48小时后，留取血样（眼内眦采血法），静置30分钟后，4ºC 离心（3000 rpm，15分钟），提取上清液，应用酶联免疫吸附法（ELISA）对血清gAcrp30水平进行检测。

1.3.3柠檬酸合酶（Citrate synthhaassee，CCSS）活性检测

柠檬酸合酶（Citrate synthase，CS）能够催化来自糖酵解或者其他异化反应的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合成柠檬酸，控制三羧酸循环的入口，是肝脏和骨骼肌等组织细胞三羧酸循环过程的限速酶。本实验检测运动干预后小鼠股四头肌组织CS活性，在组织层面确认运动干预的效果。检测步骤依据文献所述[6]。

1.3.4 Western BBlloott检测ppAAMMPPKK α--TThhrr117722、LLCC 33Ⅱ//Ⅰ、pp 6622、Beecclliinn 11蛋白表达

NP-40法提取股四头肌组织蛋白（裂解液：1%NP-40+EDTA 15 mM（pH 8.0）+NaCl 150 mM+Tris 50 mM），充分混匀；离心后取上清。制备5%积层胶，根据目的蛋白分子量，制备不同浓度分离胶，将等量总蛋白加入样品孔，随后加入电泳缓冲液，于凝胶电泳缓冲液（pH 7.6）内电泳2小时（电压：60 V转110 V）。采用湿法电转印法，转膜2小时（电流：300 mA）。根据预染蛋白Marker转移情况，判断蛋白转移情况。转膜结束后，5% 脱脂牛奶封闭1小时。在封闭过的膜上，分别孵育pAMPKα-Thr172、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin1和 β-tubulin一抗（抗体稀释比例见表1），TBST洗膜（10分钟 × 3次），二抗（1︰20000）室温孵育1小时，TBST洗膜（10分钟×3次），ECL反应液做发光底物，用X光胶片暗室曝光，扫描，应用 Image J软件定量分析结果。

1.4 统计学处理

SPSS（SPSS13.0 for Windows）统计软件处理数据，计算均值和标准差（±s）。单因素方差分析（Oneway ANOVA）进行组间分析。将P＜0.05定为组间显著差异性标准。

表1 抗体稀释比例

2 结果

2.1 体成分分析结果

6周运动结束后，MICT组小鼠体重（Body Weight）显著低于Control组（P＜0.05），而HIIT组小鼠体重更加显著地低于Control组（P＜0.01），同时也显著低于MICT组（P＜0.05），结果提示，MICT和HIIT均能有效控制健康雄性小鼠个体的体重，但就本实验结果来看，HIIT在控制体重方面的效应要优于MICT。6周运动结束后，各组的总体液量（Total body water）差异无统计学意义（P＞0.05）；HIIT组的体质指数（BMI）显著低于Control组（P＜0.01），而MICT组与Control无显著差异；此外，MICT组的体脂含量（Fat Mass）显著低于Control组（P＜0.05），而HIIT组的脂肪含量与Control相比更具显著性（P＜0.01），同时HIIT组的脂肪含量也显著低于 MICT组（P＜0.05），提示6周HIIT能有效控制运动组小鼠BMI值和体脂含量（见表2），而6周的MICT未能达到相同效果。

表2 体成分分析结果

2.2 不同运动形式对小鼠股四头肌柠檬酸合酶活性的影响

各组小鼠股四头肌CS活性检测结果如图1所示，6周MICT后小鼠股四头肌组织CS活性呈现出高于对照组的趋势，但不具有显著性效果（P＞0.05）。而6周HIIT后小鼠股四头肌组织CS活性显著高于对照组（P＜0.01），表明 HIIT干预增加骨骼肌细胞代谢、增加机体能量消耗，可能是HIIT显著降低小鼠体重、BMI和体脂含量的原因之一。

2.3 不同运动形式对小鼠血清球形脂联素水平的影响

如图2所示，HIIT组的血清gAcrp30水平显著高于对照组（P＜0.01），而MICT组仅表现出轻微上升，但不具显著性（P＞0.05）；提示与传统MICT运动方式相比，6周 HIIT能够显著增加小鼠血清gAcrp30水平。

图1 各组小鼠股四头肌柠檬酸合酶活性比较

图2 各组小鼠血清球形脂联素浓度比较

2.4 不同运动形式对小鼠骨骼肌组织自噬相关蛋白的影响

对小鼠股四头肌组织中自噬相关蛋白进行定量分析的结果如图3所示，MICT组和HIIT组小鼠骨骼肌组织AMPK-Thr172位点的磷酸化水平均显著高于对照组（P＜0.05），只有 HIIT 组中自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表达显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），p62表达显著低于对照组（P＜0.05），而MICT组中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1及p62的表达与对照组相比则没有显著变化（P＞0.05），提示HIIT能够显著增加小鼠骨骼肌组织AMPK-Thr172位点的磷酸化，增加骨骼肌细胞自噬。

3 讨论

运动作为一种减脂增肌的有效手段，已得到广泛应用。HIIT作为一种新兴的运动模式，由于其具有耗时短、能够迅速达到最大运动效率的优势，因此近些年来得到了运动员、教练员和研究人员的广泛关注[2,7]。虽然目前对HIIT尚无全面的定义，但通常是指短时间的间歇配合最大或接近于VO2max强度的运动训练[8]。HIIT作为一种省时高效的运动方式，已有研究证明其在改善心血管系统功能方面的显著作用[2]，但对其在机体内分泌代谢方面的影响，及其可能机制仍有待解决。

图3 各组小鼠骨骼肌组织自噬相关蛋白表达的对比

基于HIIT在运动训练中呈现的显著效果，针对HI⁃IT与传统MICT优越性方面的对比研究也在不断拓展，已有大量研究致力于HIIT相比MICT在提高心肺耐力、改善心肺功能方面的突出效应[9,10]，近些年来随着HIIT在全民健身运动中的推广，其在增强心肺代谢功能方面的作用也日渐凸显。有研究表明，每周3次、持续3周的高强度间歇运动，虽然对腰臀比的影响不明显，但显著降低了青少年个体的体重、BMI和身体脂肪厚度[11]。前期已有研究表明，HIIT的运动方式结合地中海饮食能够显著改善肥胖患者的体成分和胰岛素敏感性[2]，强调在HIIT过程中，饮食对于实验结果影响的重要性。本实验选用C57BL/6小鼠为研究对象，排除了基础健康水平差异对实验结果的影响。Shing等人也发现，经4周 HIIT干预后，受试个体除VO2max和最大输出功率显著增加外，受试者体脂含量也显著下降，而这些改变并未在中等强度持续运动组中出现[12]，与本实验研究结果一致。

大多数的Acrp30以全长形式存在于血浆中，而球状片段可能由活化的单核细胞和/或嗜中性粒细胞分泌的白细胞弹性蛋白酶通过切割产生[13]。有研究显示，在进行了6个月耐力运动的正常成人中，尽管胰岛素活性显著提高，但其血浆空腹Acrp30水平并未出现明显上升[14]，在本实验中，6周的MICT干预也未能增加血清gAcrp30的水平，6周的HIIT则显著增加了小鼠血清gAcrp30水平，降低了体脂含量。近些年来针对运动影响Acrp30的研究众多，但结果却大相径庭，推测运动影响Acrp30水平可能受很多因素的影响，如机体对运动的适应度、体重变化、基础健康状态、年龄、性别、训练强度、训练持续时间和训练类型等。

已知在营养缺乏、免疫应答或环境刺激等条件下，机体的自噬水平会增强。为了探究HIIT造成的细胞能量迅速消耗的状态下，骨骼肌细胞自噬应对“饥饿”的响应如何，我们对小鼠股四头肌组织自噬相关蛋白进行定量分析，结果显示，与安静对照组相比，6周的MICT和HIIT均显著增加了小鼠骨骼肌组织 AMPKThr172位点的磷酸化水平，但只有6周HIIT增加骨骼肌组织自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表达，而p62表达下降，提示6周HIIT增加了骨骼肌细胞自噬活性。

4 总结

本研究通过对比高强度间歇运动和中等强度持续运动对C57BL/6小鼠代谢表型的影响，证实了HIIT在控制体重、降低BMI以及改善体成分等方面的良好效应。同时，我们还发现与MICT组小鼠相比，HIIT在增加血清gAcrp30水平方面效果更为显著，骨骼肌细胞自噬活性增加更为显著。后续研究应侧重HIIT应用过程中相关要素的机制探讨，为今后HIIT在保障安全前提下的广泛应用以最大限度提高运动效果提供科学依据。