FMOC-Cl柱前衍生高效液相色谱法测定L-高丝氨酸内酯盐酸盐

解银萍，王滢秀，董文凯，柴洪伟

(山东省农药科学研究院 山东省化学农药重点实验室，山东 济南　250100)

L-高丝氨酸内酯盐酸盐是有机合成中被广泛应用的一种重要中间体[1]，是合成手型除草剂L-草铵膦的重要中间体[2]。L-高丝氨酸内酯盐酸盐，英文名称：L-homoserine lactone hydrochloride，CAS号：2185-03-7，分子式：C4H8ClNO2，中文名：L-高丝氨酸内酯盐酸盐。结构式：

目前，有关L-高丝氨酸内酯盐酸盐含量的分析方法尚未见公开的报道。由于L-高丝氨酸内酯盐酸盐几乎没有紫外吸收，本文运用FMOC-Cl柱前衍生化后用高效液相色谱法对L-高丝氨酸内酯盐酸盐进行定量分析。FMOC-Cl以其反应产物稳定、反应速度快和完全而成为十分理想的衍生试剂[3]，在本实验中，多余的FMOC-Cl的水解产物不影响样品的分离。实验结果表明该方法具有操作简便、快速、准确，分离效果好等特点，其精密度和准确度均能达到定量分析的要求。

1　试验部分

1.1　试剂和溶液

乙腈：色谱纯；硼酸：分析纯；氢氧化钠：分析纯；水：二次蒸馏水；FMOC-Cl：99%(购于安耐吉化学)；L-高丝氨酸内酯盐酸盐标样：97.0% (购于安耐吉化学)； L-高丝氨酸内酯盐酸盐试样：(本实验室提供)。

5.00g/L的L-高丝氨酸内酯盐酸盐标样标准储备溶液的配制：准确称取L-高丝氨酸内酯盐酸盐标准样0.25 g(精确至0.0001)，置于50 mL容量瓶中，用水溶解，定容，摇匀备用。

0. 40 mol/ L 硼酸盐缓冲溶液：将0.40mol/ L 硼酸溶液用6.0mol/ L的NaOH溶液调节 pH值到8.0。

1.0g/ L的FMOC-Cl衍生液：称取0.05g FMOC-Cl溶解于50mL的乙腈中。

所有配制的溶液均保存于 4℃冰箱中。

1.2　仪器

高效液相色谱仪：岛津LC-20AT，具有紫外检测器；岛津LC solution色谱工作站；色谱柱：WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。

1.3　液相色谱操作条件

流动相：V (乙腈)∶V (水)=50∶50；流量：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：25℃；进样体积：5μL；L-高丝氨酸内酯盐酸盐衍生样的保留时间约13.43min。

如图所示典型的L-高丝氨酸内酯盐酸盐标样衍生样和空白样的高效液相色谱图(图1、图2)。

图1　L-高丝氨酸内酯盐酸盐标样衍生样色谱图

图2　L-高丝氨酸内酯盐酸盐空白样色谱图

1.4　测定步骤

1.4.1样品预处理

取L-高丝氨酸内酯盐酸盐样品溶液0.5mL于指形瓶中，加入1mL0.4mol/L的硼酸缓冲溶液，加入2mLFMOC-Cl衍生液，震荡，暗处反应30min，待上机分析。

1.4.2测定步骤

待基线稳定后，连续进入数针L-高丝氨酸内酯盐酸盐标样衍生样溶液，直至相邻2针标样衍生样溶液的响应值相对变化<1.0%，而后按照标样、试样、试样、标样的顺序进行测定。

1.4.3结果计算

将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中L-高丝氨酸内酯盐酸盐衍生样峰面积分别进行平均。试样中L-高丝氨酸内酯盐酸盐的质量分数ω(%)，按式(1)计算：

(1)

(1)式中：

A1——标样溶液中L-高丝氨酸内酯盐酸盐衍生样峰面积的平均值；

A2——试样溶液中L-高丝氨酸内酯盐酸盐衍生样峰面积的平均值；

m1——标样的质量，g；

m2——试样的质量，g；

ω1——标样中L-高丝氨酸内酯盐酸盐的质量分数，%。

2　测定结果与讨论

2.1　色谱条件的选择

流动相的选择：根据L-高丝氨酸内酯盐酸盐的理化性质，选择常用的C18色谱柱，水作为样品溶剂，乙腈和水溶液作为混合流动相。混合不同比例的流动相在色谱柱上进行试验，最终确定流速为1.0mL/min，流动相为V (乙腈)∶V (水)=50∶50时，基线平稳，样品与杂质能够很好的分离，样品色谱峰形对称，如图1、图2所示。

检测波长的选择：利用岛津高效液相色谱仪中的全波长扫描功能，得到L-高丝氨酸内酯盐酸盐衍生样在190～370nm范围内的紫外波长扫描图(图3)。如图所示L-高丝氨酸内酯盐酸盐衍生样的最大吸收波长在207.43nm附近，故选用210 nm的检测波长。

图3　L-高丝氨酸内酯盐酸盐衍生样 190～370nm范围内的紫外吸收谱图

2.2　分析方法线性相关性测定

将L-高丝氨酸内酯盐酸盐标样标准储备液依次稀释为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的标准工作液，柱前衍生化处理后，取5μL进样，每个标准溶液重复进样2次，以标准溶液质量浓度为横坐标，以待测物色谱图的平均峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(表1、图4)。图中横坐标为标样溶液的质量浓度，纵坐标为平均峰面积，得到线性方程为y=8.2616×106x+947732， 其线性相关系数为0.9991。

表1　分析方法的线性相关性试验结果

图4L-高丝氨酸内酯盐酸盐线性关系图

2.3　方法精密度测定

在同一样品中准确称取5个0.02g(精确至0.0001)L-高丝氨酸内酯盐酸盐试样，用水溶解，定容至10mL。样品预处理后在上述所选色谱操作条件下进行分析。分析结果表明该方法测得L-高丝氨酸内酯盐酸盐的标准偏差为0.0016，变异系数为0.14%(表2)。

表2　分析方法的精密度试验结果

2.4　方法准确度测定

准确称取5个0.01g(精确至0.0001)的L-高丝氨酸内酯盐酸盐试样，再分别准确加入0.01g(精确至0.0001)的L-高丝氨酸内酯盐酸盐标样，用水溶解，定容至10mL。预处理后在上述选用的色谱操作条件下进行HPLC分析(表3)，分析结果表明该方法的测定L-高丝氨酸内酯盐酸盐的平均回收率为99.39%。

表3　分析方法的准确度试验结果

3　结论

本文建立了一种利用FMOC-Cl柱前衍生化的高效液相色谱法测定L-高丝氨酸内酯盐酸盐的定量分析方法。它采用WondaSil C18色谱柱，1.0mL/min的流速，V (乙腈)∶V (水)=50∶50的流动相，25 ℃柱温，210nm的波长进行检测。实验中还探讨了该分析方法的线性相关性，精密度和准确性，结果显示该方法的线性相关系数为0.9991，标准偏差为0.0016，平均回收率为99.39%。综上所述，该分析方法针对L-高丝氨酸内酯盐酸盐具有较高的准确度、精密度和良好的线性关系。它具有简便、快速、准确的特点，被认为是一种切实可行的分析方法。