菊叶香藜psbA基因生物信息学分析*

雷鸣任海龙

（1.西藏大学理学院；2.西藏大学医学院，西藏 拉萨 850000）

菊叶香藜是藜科刺藜属植物［1］，其具有刺激性气味，具有抑菌、昆虫活力抑制等作用［2,3］，中药用于治疗哮喘、支气管炎和偏头痛［4］，据藏药志记载有抗肿瘤活性［5］。菊叶香藜也为中等饲用植物［6］，通常情况下为亚优势种或伴生种［7］。研究发现在群落演替中重要值在明显增加，同时也可作为固定沙地的指示植物［8］。许新勇等［9］研究发现，在西藏“一江两河”流域地区，伴随着植被发育和群落演替的进程，在半固定沙丘和固定沙丘，菊叶香藜逐渐成为优势种，说明菊叶香藜本身生理生态特征非常适应“一江两河”流域气候环境。2003年，朱格鳞等在Flora of China中，基于形态学特征将菊叶香藜等植物归类到刺藜属植物［1］，并未对菊叶香藜的进行分子方面的鉴定。另外，psbA基因是叶绿体基因，序列相对保守，编码产物D1蛋白，是PSⅡ反应中心2个核心蛋白之一，介导光合作用过程中的电子传递［10］，在植物属以上水平的分子系统发育的比较中具有显著作用［11］。因此，在本研究中，通过菊叶香藜psbA序列生物信息学分析和系统发生树构建，为菊叶香藜的分类学提供分子依据。

1 方法

1.1 基于转录组测序对菊叶香藜psbA基因全序列的获取

通过转录组测序，将注释到psbA基因的unigenes在NCBI进行比对，然后再进行拼接。

1.2 菊叶香藜psbA基因编码序列生物信息学分析

通过NCBI在线分析软件ORF Finder对核苷酸序列进行分析，预测出可能的氨基酸序列；通过蛋白质二级结构在线预测软件PredictProtein，预测出氨基酸序列的二级结构、相对亲水表面、氨基酸组分和核苷酸组分；用CondonW和CUSP对菊叶香藜psba基因编码序列进行密码子偏好性分析，基于中性绘图和ENC-plot探索影响psba基因密码子偏好性的因素；psba基因编码蛋白的理化性质采用ExPasy-ProtParam分析软件及BioEdit软件预测；疏水性/亲水性采用Ex-Pasy-ProtScale预测；跨膜区域通过软件TMHMM进行分析；结构功能域及功能分类采用ProtFun预测；通过Swiss-Model在线预测软件预测出三级结构；通过BioEdit进行序列差异分析；用MEGA6.05计算菊叶香藜与其近缘物种的遗传距离，并构建系统进化树。

1.3 菊叶香藜psbA基因系统发生树构建

从NCBI数据库中下载其它物种psbA基因完整序列，共9个物种（表1）。

表1 NCBI数据库中下载9个物种psbA基因完整序列

2 结果

2.1 菊叶香藜psbA基因编码序列生物信息学分析

2.1.1 菊叶香藜psbA基因编码蛋白理化性质。基于转录组测序，将注释到psbA基因的unigenes（c1846_g1、c19645_g1、c24547_g1）在NCBI数据库中进行比对，然后拼接在一起，最终的序列长度为1059bp，GC含量为41%，序列已上传到NCBI数据库，序列号为：KY942083。

通过NCBI在线分析软件ORF Finder对核苷酸序列进行分析，预测出氨基酸序列，共353个氨基酸，如下所示：MTAILERRESESLWGRFCNWITSTENRLYIGWFGVL MIPTLLTATSVFIIAFIAAPPVDIDGIREPVSGSLLYGN NIISGAIIPTSAAIGLHFYPIWEAASVDEWLYNGGPYE LIVLHFLLGVACYMGREWELSFRLGMRPWIAVAYSA PVAAATAVFLIYPIGQGSFSDGMPLGISGTFNFMIVFQ AEHNILMHPFHMLGVAGVFGGSLFSAMHGSLVTSSLI RETTENESANEGYRFGQEEETYNIVAAHGYFGRLIFQ YASFNNSRSLHFFLAAWPVVGIWFTALGISTMAFNLN GFNFNQSVVDSQGRVINTWADIINRANLGMEVMHER NAHNFPLDLAAIEAPSING

负电荷残基总数为28，正电荷残基总数为15,其理论分子量为38962.62Da，理论等电点为5.12，不稳定指数是36.33。分子式为C1793H2682N456O493S14，原子总数为5438，脂肪系数为96.77。

2.1.2 菊叶香藜psbA基因编码蛋白氨基酸组分分析。氨基酸组分中最多的为A 35(9.9%)，最少的为C 2（0.6%），其中，没有氨基酸K；相对亲水表面为71.67%在0-16%之间，28.33%在16%-100%之间。（如图1所示）

图1 菊叶香藜psbA基因编码蛋白氨基酸组分

2.1.3 菊叶香藜psbA基因编码蛋白二级结构。通过蛋白质二级结构在线预测软件PredictProtein，预测出氨基酸序列的二级结构为α-螺旋57.51%，β-折叠4.82%，β-转角37.68%.

2.1.4 菊叶香藜psbA基因编码蛋白亲疏水性分析。用ProtParam分析软件对菊叶香藜psbA基因编码蛋白的疏水性/亲水性进行预测，其疏水性平均系数为0.350。参照ExpASy的Protscale程序计算菊叶香藜psbA基因编码蛋白的疏水性/亲水性图谱（图2）分析氨基酸残基的得分可知，多肽链的第51号的丙氨酸(Ala)具有最高分值3.189，疏水性最强。第234号天冬酰胺(Asn)具有最低分值-2.133，亲水性最强。

图2 菊叶香藜psbA基因编码蛋白亲疏水性分析

2.1.5 菊叶香藜psbA基因编码蛋白跨膜区域。由图3可知，菊叶香藜psbA基因编码蛋白存在7个跨膜区域，分别位于29～51、71～93、105～127、142～164、171～193、197～219和273～295氨基酸之间，跨膜区分析结果与该蛋白的亲/疏水性分析结果基本一致。

图3 菊叶香藜psbA基因编码蛋白跨膜区域

2.1.6 菊叶香藜psbA基因编码蛋白结构功能域及功能分类。通过Protfun分析软件预测菊叶香藜psbA基因编码蛋白结构功能域及功能分类从分析结果可知（表2），菊叶香藜psbA基因编码蛋白为非酶类(Prob=0.805，odds=1.128)和转运相关蛋白(Prob=0.191,odds=1.749)，该蛋白具有翻译、脂肪酸代谢、辅酶因子的生物合成和能量代谢作用的可能性分别为4.760、4.477、3.423和2.195。因此，推测该蛋白的主要作用与转运有关。

表2 psbA基因编码的蛋白质的功能预测

2.1.7 菊叶香藜psbA基因编码蛋白三级结构预测。通过Swiss-Model在线预测软件预测出三级结构，选取Template＞30%、GQME值接近1、|QMEAN|＜4的模型，预测出的菊叶香藜psbA基因编码蛋白三级结构（图4）。

图4 菊叶香藜psbA基因编码蛋白三级结构预测模型

2.1.8 菊叶香藜psbA基因密码子偏好性。通过CUSP和CondoW程序分析菊叶香藜及其近缘种psbA基因的密码子偏好性基本指标。从表3中可以看出，各物种psbA基因在密码子偏好性方面差异较小，其中CBI、GC含量、GC3和GC3s，苋科植物均大于藜科植物，而ENC值，苋科植物均小于藜科植物。GC1、GC2、GC3和GC含量均小于0.5，说明psbA基因密码子各位点均偏好使用含A/T的密码子，而GC3s均小于0.3，说明在同义密码子中，psbA编码序列更偏好使用以A/T结尾的密码子,其中，NNT＞NNA＞NNC＞NNG,NNT远大于NNC。ENC值均位于35-50之间，说明psbA基因密码子偏好性一般，基因表达水平一般。

通过CUSP和CondoW程序分析菊叶香藜psbA基因的密码子偏好性可知，菊叶香藜psbA基因总共使用了49个密码子，23个密码子为偏好性密码子(RSCU＞1)，其中 GCU、GAU、GAA、GGU、AUU、CUA、UUA、CCU、CAA、CGU、AGU、UCU、ACU和GUA为高频密码子（RSCU＞1.5），以GU和CU结尾的密码子全部为高频密码子。在偏好性密码子中，有18个密码子以A/T结尾，这18个密码子Fraction和使用频率(Frequency)都相对较高（表4）。

为探索影响psbA基因密码子偏好性的因素，通过中性绘图和ENC-plot绘图进行分析。中性绘图结果显示(图5所示)，GC12与GC3相关性不显著（R2=0.1，P=0.251），说明psbA基因密码子第1、2位和第3位碱基相关性不显著，psbA基因GC含量高度保守，密码子偏好性主要受选择作用影响。

ENC绘图结果显示（图6），所有物种的psbA基因均落在标准曲线下方相对较远的位置，说明密码子的偏好性只受到选择作用的影响。进一步探究影响选择作用的因素，本研究主要分析CAI值和蛋白长度对ENC值的影响，发现CAI值与ENC值表现为极显著的负相关（R2=0.6817，P＜0.01，回归方程为：y=-37.053x+51.522），蛋白长度与ENC值表现为完全线性相关（x=353）。因此，选择作用主要受到表达水平和蛋白质长度的影响，psbA基因密码子偏好性受到表达水平和蛋白质长度的的影响。

表3 菊叶香藜及其近缘种psbA基因的密码子偏好性基本指标

表4 CUSP和CondoW程序分析菊叶香藜psbA基因的密码子偏好性

图5 GC3和GC12中性绘图结果

图6 GC3s和ENC绘图结果

2.1.9 菊叶香藜psbA基因系统发生树结果。由菊叶香藜及其近缘物种的psba完整序列生成的系统进化树可知（图7），系统树上聚为两大支，藜科和苋科各聚为一大支，说明在藜科和苋科中，psbA基因存在差异。而对于藜科这一支来说，psbA基因在藜科各属之间差异相对较大；各进化支部分种间自展值为100%，说明psbA序列对于种的鉴定存在一定的局限性。菊叶香藜原为藜科藜属植物，但在近年来的藜属与刺藜属的争议中，被划为藜科刺藜属中，从图7中我们可知，菊叶香藜与藜属植物分别聚为一支，正好与形态学分类上的观点一致。

图7 菊叶香藜psbA基因系统发生树结果（“●”为菊叶香藜）

3 讨论

菊叶香藜psbA基因编码序列长度为1059bp，GC含量为41%，共编码353个氨基酸，最多的为丙氨酸(A)，为35个(9.9%)，不含有赖氨酸，符合psbA基因的特征。二级结构包含α-螺旋(57.51%)，β-折叠(4.82%)，β-转角(37.68%)。psbA 基因编码蛋白为疏水性蛋白，包含7个跨膜区域，是非酶类转运蛋白。psbA基因密码子偏好性水平相对较弱，主要受到选择作用、表达水平和蛋白质长度的影响，该结果与尚明照等［12］研究结果一致，为进一步研究影响psbA基因密码子偏好性的因素提供依据。在同义密码子中，psbA编码序列更偏好使用以 A/T 结尾的密码子,其中，NNT＞NNA＞NNC＞NNG,NNT远大于NNC，与侯惠静［13］研究结果不一致，与侯士昌等［14］研究结果一致。系统发生树的结果证明菊叶香藜与藜属植物存在差异，支持将其划归到刺藜属中。