单链抗体联合治疗仔猪病毒性腹泻病的效果研究

张凡庆　陈玉雪　杨　亮　龚建培　朱建国*

（1上海交通大学农业与生物学院/上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240；2上海富朗特动物保健股份有限公司，上海 201502；3浙江海正动物保健品有限公司，浙江台州 318099）

随着养猪业的发展，猪场的规模逐渐变大，猪群数量变多，同时一些疾病非常容易在猪场传播，特别是猪腹泻病。目前猪腹泻病的发病原因分为两类：传染性疾病引起的腹泻和非传染性因素造成的腹泻。传染性腹泻是由病毒、细菌引起，病毒包括流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒等；细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌等。非传染性腹泻因素包括仔猪消化功能不全、日粮抗原过敏、食入腐败饲料、应激因素等。非传染性腹泻危害小且治愈快，而传染性疾病危害较大，特别是病毒性疾病，通常迅速感染整个猪场，造成仔猪大量腹泻和死亡，给养猪业造成巨大的经济损失。

病毒性腹泻最常见的病原有两种：流行性腹泻病毒（PEDV）和传染性胃肠炎病毒（TGEV）[1,2]。PEDV和TGEV都能够引起猪的呕吐、水样腹泻和脱水症状，各年龄段都能发病，2周龄以内的仔猪发病率和死亡率最高，甚至达到100%。TGEV和PEDV均属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子呈圆形或椭圆形，外有囊膜，直径80～100 nm，为RNA病毒。病毒结构蛋白包括纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），这些病毒蛋白介导了病毒的感染、入侵和释放等多个过程[3]。众所周知，这两种病毒感染所致的仔猪腹泻表现为发病急、机体脱水严重、营养状况恶化，经常未来得及治疗发病仔猪就已衰竭死亡。这一现象在本课题组前期利用单链抗体进行现场治疗时也曾出现。

在生产实践中，许多一线技术人员通常将奶粉与温开水冲泡后代替母乳饲喂仔猪，补充仔猪所需的各种营养，提高仔猪免疫力和快速促进仔猪的生长。此外，当仔猪发生如腹泻病等疾病时，饲喂乳制品也能够加速病畜的康复，提高存活率。受此启发，本研究将课题组前期制备、经仔猪保护试验证实具有良好保护效果的抗PEDV和TGEV的scFv与奶粉联合应用，分析该方法在发病猪场的临床治疗价值。

1　材料

His-Trap纯化树脂购自英国GE公司；PBS缓冲液购自Thermo公司；5×SDS-PAGE电泳缓冲液购自碧云天生物科技有限公司。

2　方法

2.1　scFv的纯化

从-20℃取出冻存的携带scFv基因的菌株（分别与pET-28a(+)载体连接），接种至2YT-K平板上，37℃培养过夜。第2天挑取单菌落接种至2YT液体培养基中，待OD600nm达到0.6时加入10 mM IPTG，过夜诱导。将诱导后的菌液超声破碎后取上清，使用AKTA purifier纯化系统进行纯化。

取纯化后的少量样品加入5×SDS-PAGE电泳缓冲液，煮沸10分钟后进行10%SDS-PAGE电泳，分析纯化后蛋白的纯度。

2.2　仔猪腹泻治疗试验

试验在一个正在流行仔猪腹泻病的猪场进行。该猪场先前的ELISA和PCR实验证实猪群感染了PEDV和TGEV，仔猪感染后连续腹泻和呕吐，4～5天出现大量死亡。剖检发现胃内有大量内容物，胃壁和小肠出血，伴有肠壁臌胀和变薄，肠系膜淋巴结出血；粪便呈水样黄色。

仔猪的分组和处理情况见表1。一共分为3个处理组，第1个处理组包括母猪栏号A和B，对仔猪灌胃抗体和奶粉；第2个处理组包括母猪栏号C和D，对仔猪灌胃抗体，不使用奶粉；第3个处理组包括母猪栏号E和F，对仔猪只灌服奶粉，不灌服抗体。抗体每次灌胃量为3 mL，浓度为0.5 mg/mL，灌胃时间为0小时、24小时和72小时；人工喂奶时间分别为10小时、14小时和36小时。抗体处理后24小时开始记录仔猪的拉稀和存活情况。

3　结果

3.1　抗PEDV和TGEV scFv的纯化

将原核表达的菌液使用超声破碎仪进行裂解，裂解后的产物离心后取上清用AKTApurifier系统进行纯化。紫外分光光度计测定PEDV scFv和TGEV scFv的OD260nm/OD280nm值分别为0.882和0.865，说明蛋白纯度较高。根据蛋白浓度=（1.55×OD280nm）-（0.76×OD260nm）公式计算得出PEDV scFv和TGEV scFv的浓度分别为1.622 mg/mL和1.681 mg/mL。

表1　试验仔猪分组情况

将纯化后的scFv进行SDS-PAGE电泳，结果证实纯化的蛋白在28 kDa处出现单一的条带，且纯度较高（见图 1）。

图1　scFv的SDS-PAGE电泳

3.2　仔猪腹泻治疗实验

scFv+奶粉处理组（A、B）的平均存活率为72.7%，scFv处理组（C、D）的平均存活率为65%，只加奶粉组（E、F）的平均存活率仅为8.3%。t检验计算得出scFv+奶粉处理组、scFv组的治疗效果明显优于只加奶粉组（＜0.01） （见图2）。scFv+奶粉处理组比scFv处理组存活率提高了7.7%，虽然t检验差异不显著，但也能看出添加奶粉对提高机体免疫力有一定效果。

4　讨论

4.1　scFv纯化方法

原核表达的蛋白产物通常使用His标签，便于纯化。本研究中的scFv基因序列与pET-28（+）载体连接，也携带His标签。普通实验室纯化使用重力纯化蛋白，虽然操作方便，但是纯化量不高。为了满足临床大量应用的需要，本研究使用了AKTA蛋白快速纯化系统纯化蛋白，该系统使用惰性气体管道，环境温和，可以减少对蛋白质活性的影响；能够快速大量纯化重组蛋白，进行中试生产；具有3个分析器（紫外/可见光检测器、电导检测器、pH检测器），能够直接对纯化样品分析[6]。

表2　仔猪存活情况

图2　仔猪腹泻治疗的存活率

4.2　scFv治疗效果

目前对PEDV和TGEV的防治以疫苗免疫为主。TGEV的变异程度较PEDV低，因此比较容易防控。PEDV在2010年时出现了变异株，传统的疫苗不能对变异株起到保护作用，造成了该病在猪场的大规模流行，给我国养猪业造成巨大的经济损失[5]。本研究中使用的scFv针对目前变异的PEDV，先前的细胞和动物实验也证明该scFv具有中和及保护作用。

本研究证实scFv对PEDV和TGEV的共同感染具有很好的治疗效果。scFv单独处理后仔猪的存活率达到65.0%，而不使用scFv的仔猪存活率只有8.3%，证明scFv具有很好的治疗作用。同时scFv+奶粉共同处理组使仔猪的存活率进一步提高到72.7%，提示抗体和奶粉具有共同使用的临床价值。值得注意的是，本次实验中scFv与奶粉为分开饲喂，而先前的研究表明当抗体与乳汁共同饲喂时，乳汁中的成分还能够减少抗体被胃酸的破坏，提高抗体的有效治疗量[7]。将抗体与奶粉同时投喂仔猪是否具有更好的治疗效果有待于进一步研究。