声光可调—近红外漫反射光谱法快速评价黄芪药材质量

任绪华　苏婷　姜文月　李亚东　郑广晶　高陆

中图分类号 R978.7 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）02-0168-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.06

摘 要 目的：建立快速评价黄芪药材质量的方法。方法：采用烘干法测定黄芪药材样品水分含量，采用高效液相色谱（HPLC）-蒸发光散射检测法（ELSD）测定黄芪甲苷的含量，采用HPLC法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量（均作为参考值）。采用声光可调-近红外漫反射光谱法结合偏最小二乘法建立预测黄芪药材中上述指标含量的定量模型（作为预测值）。根据参考值，采集60批药材样品，采用一阶导数联合平滑降噪法预处理光谱，水分、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量预测的最佳波段分别为1 100～2 300、1 080～2 160、1 170～2 230 nm。结果：药材样品中水分、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法学考察符合要求。水分、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷定量模型校正均方根偏差分别为0.132 3、0.006 6、0.002 5，预测均方根偏差分别为0.237 1、0.016 3、0.004 7，校正集内部交叉验证相关系数分别为0.975 9、0.953 3、0.968 0；定量模型内部验证偏差分别为1.43%、1.90%、1.84%，外部验证偏差分别为1.73%、2.68%、2.71%。结论：该方法快速、准确、简便、无污染，可用于黄芪药材质量的快速评价。

关键词 近红外漫反射光谱法；声光可调；黄芪；水分；黄芪甲苷；毛蕊异黄酮葡萄糖苷

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for rapid quality evaluation of Astragali Radix. METHODS： The moisture of medicinal material was determined by oven drying method； the content of astragaloside Ⅳ was determined by HPLC-ELSD； the content of isoflavone glucoside was determined by HPLC （as reference value）. The partial least squares （PLS） method combined with acousto-optic turnable filter-NIDRS was adopted to build quantitative model of above indexes in Astragali Radix （as predict value）. According to reference value， 60 batches of sample were collected. The spectra pretreatment was conducted by first derivative method combined with Savitzky golay. The optimal bands of moisture， astragaloside Ⅳ and isoflavone glucoside were 1 100- 2 300 nm，1 080-2 160 nm，1 170-2 230 nm，respectively. RESULTS： The content determination of moisture， astragaloside Ⅳ and isoflavone glucoside in samples were all in line with methodology requirements. The corrected mean square root deviation of quantitative model for moisture， astragaloside Ⅳ， calycosin glucoside were 0.132 3， 0.006 6， 0.002 5， respectively； predicted mean square root deviation were 0.237 1， 0.016 3， 0.004 7； internal cross validation coefficient of correction set were 0.975 9， 0.953 3， 0.968 0； internal verification deviation of quantitative model were 1.43%， 1.90%， 1.84%； external verification deviation were 1.73%， 2.68%， 2.71%， respectively. CONCLUSIONS： The method is rapid， accurate，simple，pollution-free， and can be used for rapid quality evaluation of Astragali Radix.

KEYWORDS NIDRS； Acousto-optic turnable filter； Astragali Radix； Moisture； Astragaloside Ⅳ； Isoflavone glucoside

中藥材在采购、验收、入库、投料过程中存在着质量检测程序繁杂、费时长等问题，不能满足大批量的现场快速分析要求。为解决该问题，有必要研发涵盖水分、浸出物、特征性成分等不同检测项目的快速检测方法作为企业内部质量控制标准。

近红外漫反射光谱法（NIR）作为一种快速分析方法，具有很多优点，如快速、无损、环保，并可对固体、液体和气体样品直接进行测定，无需复杂的前处理过程[1]。随着仪器与软件的发展，NIR法已广泛应用于农业、生物医学、石油化工等领域[2-4]。

黄芪药材为豆科植物蒙古黄芪[Astragalus membranaceus（Fisch） Bge. var. mongholicus（Bge.） Hsiao]或膜荚黄芪[A. membranaceus（Fisch.） Bge.]的干燥根，化学成分以皂苷和黄酮类化合物为主，具有调节免疫功能、促进造血功能等作用[5]，是多种中成药的主要原药材之一。本研究中，笔者以黄芪药材样品中水分、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷为指标，应用声光可调（AOTF）-NIR法结合偏最小二乘法（PLS）[6]，建立了快速通用的多指标测定方法，旨在为中药材整体质量的快速评价提供借鉴。

1 材料

1.1 仪器

Luminar-5030 型NIR仪，包括样品旋转台、石英样品杯、 SNAP 光谱分析软件、CAMO 化学计量学软件（美国Brimrose公司）；U3000型高效液相色谱（HPLC）仪（美国 Thermo 公司）；The Unscrabler软件（挪威CAMO公司）；L-3000 型HPLC仪，包括L-3530型蒸发光散射检测器（ELSD）（北京普源精电科技有限公司）；GZX-9070 MBE型鼓风干燥箱（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；AB135-S型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 试剂

黄芪甲苷对照品（批号：110781-201515，纯度：>93%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：111920- 201505，纯度：>97.1%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

60批黄芪药材来源于内蒙古、山西、甘肃、辽宁、黑龙江等省区，由吉林省现代中药工程研究中心有限公司提供，经长春中医药大学李焕荣教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 参考值的测定

2.1.1 水分含量测定 取药材样品粉末（过4号筛）约3 g，平铺于干燥至恒质量的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，精密称定，开启瓶盖在100～105 ℃干燥5 h；將瓶盖盖好，置于干燥器中，放冷30 min，精密称定，再在上述温度下干燥1 h；放冷，称定质量，重复至连续两次质量差异不超过5 mg为止。根据减失的质量，可知药材样品中含水量。结果，药材样品中水分含量为5.11%～9.38%，详见表1。

2.1.2 黄芪甲苷含量测定 （1）色谱条件。色谱柱：Shimadzu-GL C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-水（32 ∶ 68，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 ?L。色谱见图1。（2）对照品溶液的制备。精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成黄芪甲苷质量浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液。（3）供试品溶液的制备。取药材样品粉末（过4号筛）约4 g，精密称定，置于索氏提取器中，精密加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h；回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷；通过 D101型大孔树脂（内径为1.5 cm，柱高为12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇溶液30 mL洗脱，弃去洗脱液，继续用70%乙醇溶液80 mL洗脱；收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。（4）方法学考察。按相关标准进行方法学考察。结果，精密度、稳定性、重复性试验中黄芪甲苷峰面积的 RSD均小于1.8%，表明仪器精密度、溶液稳定性、方法重复性均较好。（5）药材样品中黄芪甲苷含量测定。取60批药材样品各适量，按“（3）”项下方法制备供试品溶液，再按“（1）”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算药材样品中黄芪甲苷的含量。结果，药材样品中黄芪甲苷含量为0.033 8%～0.289 8%，详见表1。

2.1.3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定 （1）色谱条件。色谱柱：Shimadzu-GL C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，20%A→40%A；20～30 min，40%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 ?L。色谱见图2。（2）对照品溶液的制备。精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度为50 μg/mL的对照品溶液。（3）供试品溶液的制备。取药材样品粉末（过4号筛）约1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加甲醇50 mL，称定质量，加热回流4 h，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。（4）方法学考察。按相关标准进行方法学考察。结果，精密度、稳定性、重复性试验中毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD均小于1.3%，表明仪器精密度、溶液稳定性、方法重复性均较好。（5）药材样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定。取60批药材样品各适量，按“（3）”项下方法制备供试品溶液，再按“（1）”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算药材样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。结果，药材样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为0.007 7%～0.211 3%，详见表1。

2.2 NIR定量模型建立与验证

2.2.1 NIR的采集 采样方式：样品杯固体采样。采集条件：扫描间隔2 nm，扫描范围为1 000～2 500 nm，扫描300次[7]。每批药材样品采集3张光谱，计算平均光谱以建立模型，每次扫描前振荡样品杯。药材样品的装样厚度、装填的紧密性和颗粒均匀性等在试验中都力求一致，以减小对结果的影响。60批药材样品的近红外光谱叠加图见图3。

2.2.2 校正集和验证集样品的选择 根据“2.1”项下水分、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量分布情况，从 60 批药材样品中选取一定数量组成校正集，用于建立NIR模型；其余药材样品组成验证集，用于验证模型，详见表 2。

运用The Unscrambler软件对表1数据进行处理，以PLS 法建立NIR定量分析模型。选择R2、RMSEC为评价指标，综合评价不同模型的准确性与适用性。其中，R2越接近 1，NIR 预测值与参考值相关性越好；RMSEC 越小，所建定量分析模型适用性越强、预测效果越好[10]。结果表明，以FD+SG法预处理效果最好，可以消除多重光谱偏差；对导数光谱进行微调处理，经最佳光谱预处理方法处理后得NIR，详见图4。

2.2.4 建模波段的选择 建模波段要求在包含药材样品大量信息的同时避免冗余信息，降低噪声干扰。采用 FD+SG法对不同的波段进行手动优化比较，通过 The Unscrambler 软件分析得到水分含量预测最佳波段为1 100～2 300 nm，黄芪甲苷含量预测最佳波段为1 080～2 160 nm，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量预测最佳波段为1 170～2 230 nm，详见表4。

2.2.5 定量模型的建立 运用 The Unscrambler 软件对校正集55批药材样品进行建模，对光谱采用 FD+SG法预处理，在“2.2.4”项下波段内对3个指标进行建模。结果，预测值与参考值的相关性较高，且结果很接近，表明该模型的性能较好，可以用于黄芪药材中多指标的定量分析。校正集样品NIR模型见图5。

2.2.6 定量模型的验证 选择校正集和验证集样品分别进行内部验证和外部验证，将其NIR输入定量模型，预测各指标含量，再与含量测定参考值进行比较，计算偏差，结果见表5（注：表中RMSEP为预测均方根偏差）。

3 讨论

本试验利用AOTF-NIR法建立了快速测定黄芪药材中水分、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的分析方法，选用各指标的特征光谱区间，并根据不同分析对象优选出合适的预处理方法，对NIR原始光谱进行预处理，进而采用 PLS 法建立了各指标含量的NIR 定量模型。

结果表明，本方法快速、准确、简便、无污染，可用于黄芪药材质量的快速评价。虽然NIR法的准确度不及HPLC法，但因其上述特点，能满足工业生产中大批量采集药材样品化学信息的需求，适用于快速測定药材中多指标含量，可与法定标准一起构建准确、便捷、普适性强的中药材整体质量快速评价方法体系，对保障最终制剂产品质量的稳定可控具有重要意义。

参考文献

[ 1 ] 王宁，蔡绍松，魏红，等. 声光可调-近红外光谱技术快速分析复方丹参片中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的新方法[J]. 中国中药杂志，2008，33（3）：261-264.

[ 2 ] 褚小立，陆婉珍. 近五年我国近红外光谱分析技术研究与应用进展[J]. 光谱学与光谱分析，2014，34（10）：2595-2605.

[ 3 ] 周昭露，李杰，黄生权，等. 近红外光谱技术在中药质量控制应用中的化学计量学建模：综述和展望[J]. 化工进展，2016，35（6）：1627-1645.

[ 4 ] 卢福洁，狄艳全. 近红外光谱分析技术在油品领域的应用[J]. 中国设备工程，2012（12）：9-10.

[ 5 ] 高月颖. 黄芪的药理作用及临床应用分析[J]. 中国医药指南，2016，14（28）：194-195.

[ 6 ] 冼瑞仪，黄富荣，黎远鹏，等. 可见和近红外透射光谱结合区间偏最小二乘法（iPLS）用于橄榄油中掺杂煎炸老油的定量分析[J]. 光谱学与光谱分析，2016，36（8）：2462-2467.

[ 7 ] 苏婷，李亚东，郑广晶，等. AOTF-NIR快速检测丹参中丹参酮Ⅰ含量的新方法[J]. 世界最新医学信息文摘，2017，17（68）：196-197.

[ 8 ] 王动民，纪俊敏，高洪智. 多元散射校正预处理波段对近红外光谱定标模型的影响[J]. 光谱学与光谱分析，2014，34（9）：2387-2390.

[ 9 ] 贾灿潮，卢慧娟，刘喜乐，等. NIRS法快速测定制何首乌中醇溶性浸出物的含量[J]. 药物分析杂志，2016，36（3）：554-558.

[10] 周文婷. 巴戟天近红外光谱的研究[D].广州：广东药学院，2015.

（收稿日期：2017-04-22 修回日期：2017-06-16）

（编辑：张 静）