多指标综合评分法优选芩蒿滴鼻剂提取工艺

2018-07-12毛艳陈振东顾政一贺金华蔡晓翠刘燕

中国中医药信息杂志 2018年4期

毛艳　陈振东　顾政一　贺金华　蔡晓翠　刘燕

摘要：目的探讨多指标综合评分法优选芩蒿滴鼻剂的提取工艺。方法采用L9（34）正交设计，以一枝蒿酮酸、绿原酸、盐酸伪麻黄碱、总黄酮含量及出膏率的综合评分为考察指标，优选芩蒿滴鼻剂的提取工艺。结果最佳提取工艺为：用60%乙醇溶液，加12倍量，提取3次。结论本研究优选出的提取工艺简单、可行，适合大生产需要，可作为该制剂合理开发的依据。

关键词：芩蒿滴鼻剂；提取工艺；正交试验；一枝蒿酮酸；绿原酸；盐酸伪麻黄碱；总黄酮

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.017

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0082-05

Abstract： Objective To optimize extraction process of Qinhao Nasal Drops by multi-index comprehensive evaluation Method. Methods With L9（34） orthogonal design， the content of rupestonic acid， chlorogenic acid， pseudoephedrine hydrochloride， total flavonoids and extract yield were set as indexes， and extraction technology of Qinhao Nasal Drops was optimized. Results Optimum extraction technology was： 12 times amount of 60% ethanol， extracted three times. Conclusion The optimized extraction technology is simple， practical， and adapt to the production needs， which can be used as the basis for reasonable development of the preparation.

Keywords： Qinhao Nasal Drops； extraction process； orthogonal test； rupestonic acid； chlorogenic acid； pseudoephedrine hydrochloride； total flavonoids

芩蒿滴鼻剂由维吾尔药新疆一枝蒿、苍耳子、麻黄等7味药组成，为新疆经典验方制剂，具有清热解毒、宣肺平喘、抗炎、抗过敏、通鼻窍等功效，用于治疗急、慢性鼻炎及过敏性鼻炎。方中君药新疆一枝蒿具有抗炎、抗过敏、祛风解毒等功效[1-3]，目前研究中多将倍半萜类化合物一枝蒿酮酸作为质量控制的一个重要指标。现代药理学研究表明，苍耳子中的酚酸类化合物绿原酸具有抗炎和镇痛等药理作用[4-5]。麻黄中麻黄碱及伪麻黄碱的含量最高，研究表明，盐酸伪麻黄碱可选择性地收缩上呼吸道毛细血管，消除鼻咽部黏膜充血、肿胀、减轻鼻塞等症状。此外，新疆一枝蒿、苍耳子和麻黄中均含有黄酮类化合物[6-8]，此类化合物具有抗菌、抗过敏、抗炎和抗病毒等多种生物活性及药理作用，因其功效与本研究的方向相关，故将总黄酮作为一项检测指标纳入研究。鉴于出膏率常作为中药复方提取效果的评价指标，本研究将上述4种成分的含量与出膏率作为检测指标，采用L9（34）正交试验法优选芩蒿滴鼻剂的提取工艺，为芩蒿滴鼻剂的后续研究及开发提供参考。

1 仪器与试药

DZTW型调温电热套（北京市永光明医疗仪器厂），DT500A型电子计数天平（常熟市金羊砝码仪器有限公司，d=0.01 g），CPA-225D型电子天平（德国Sartorius，d=0.01 mg），UltiMate 3000系列高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器、四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱和4～40 ℃恒温箱（美国Thermo Scientific Technologies公司）。

绿原酸对照品（批号110753-201415，纯度96.2%），盐酸伪麻黄碱对照品（批号171237-201510，纯度99.8%），芦丁对照品（批号100080-201610，纯度92.6%），中国食品药品检定研究院；一枝蒿酮酸对照品（批号115473-63-7，纯度>98%），中国科学院新疆理化所；白芷、苍耳子、麻黄，购于安徽省亳州市華云在中药饮片有限公司，经新疆药物研究所何江副研究员鉴定，分别为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.Et Hook.f的干燥根、菊科植物苍耳Xanthium sibicum Patr.的干燥成熟带总苞的果实、麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf的干燥草质茎，均符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）各药项下有关规定[9]。新疆一枝蒿购于新疆银朵兰维药股份有限公司，经新疆药物研究所何江副研究员鉴定为菊科植物一枝蒿Artemisia rupestris L.的干燥全草，符合《新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范》有关规定[10]。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

按处方比例称取各药约50 g，共9份，按正交设计表中方案用60%乙醇溶液加热回流提取，提取液过滤，用相应溶剂定容至2 L，摇匀，即得。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 绿原酸对照品溶液

精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.380 57 mg的溶液，即得。

2.2.2 一枝蒿酮酸对照品溶液

精密称取一枝蒿酮酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.454 mg的溶液，即得。

2.2.3 盐酸伪麻黄碱对照品溶液

精密称取盐酸伪麻黄碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.293 8 mg的溶液，即得。

2.2.4 芦丁对照品溶液

精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.203 6 mg的溶液，即得。

2.3 绿原酸、一枝蒿酮酸和盐酸伪麻黄碱含量测定

2.3.1 色谱条件的建立

色谱柱：Phenmomenex synergiTM（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流动相：A为乙腈，B为0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺），梯度洗脱（0～10 min，99%B；10～10.5 min，99%～91%B；10.5～28 min，91%B；28～28.5 min，91%～75%B；28.5～51 min，75%～64%B；51～53 min，64%B；53～53.5 min，64%～25%B；53.5～57.5 min，25%B；57.5～58 min，25%～99%B；58～68 min，99%B）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：211 nm（盐酸伪麻黄碱），243 nm（一枝蒿酮酸），329 nm（绿原酸）。色谱图见图1。

2.3.2 线性关系考察

分别精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 mL一枝蒿酮酸对照品溶液于5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=592.17X-0.019 1，r=0.999 9，表明一枝蒿酮酸在0.009 1～0.181 6 mg/mL范围内线性良好。

分别精密量取0.2、0.6、1、3、4、6 mL绿原酸对照品溶液于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=537.95X+0.174，r=0.999 9，表明绿原酸在0.007 6～0.228 3 mg/mL范围内线性良好。

分别精密量取0.1、0.2、0.6、1、1.5、3 mL盐酸伪麻黄碱对照品溶液于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=316.84X+0.196 4，r=0.999 8，表明盐酸伪麻黄碱在0.002 9～0.088 1 mg/mL范围内线性良好。

2.3.3 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样6次，按“2.3.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，结果绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱的峰面积RSD分别为0.56%、0.72%、1.24%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、6、8、12、24 h测定，按“2.3.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量，结果绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱的峰面积RSD分别为0.56%、0.94%、1.28%，其峰形和含量变化不大，表明溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验

取样品6份，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量，结果绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱的含量RSD分别为0.96%、1.02%、1.42%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

称取处方药材约25 g，共6份，分别按100%浓度比例加入各对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，结果绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱的平均回收率分别为99.92%、98.27%、97.83%，RSD分别为0.85%、1.13%、1.71%。

2.4 总黄酮含量测定

2.4.1 线性关系考察

分别精密量取1.5、2、3、4、5、6 mL芦丁对照品溶液于25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，用紫外-可见分光光度法[2015年版《中华人民共和国药典》（四部）附录ⅤA]，于512 nm波长处测定吸光度[9]，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=0.013 6X-0.010 6，r=1，表明芦丁在12.216～48.864 μg/mL范围内线性良好。

2.4.2 样品测定方法

精密量取“2.1”项下供试品溶液2 mL，置25 mL量瓶中，按“2.4.1”项下方法，自“加水至6 mL”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的质量，计算，即得。

2.4.3 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果总黄酮的峰面积RSD=1.17%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、6、8、12、24 h测定，记录峰面积并計算含量，结果总黄酮的峰面积RSD=1.12%，其峰形和含量变化不大，表明溶液在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验

取样品6份，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下方法进行测定，记录峰面积并计算含量，结果总黄酮含量RSD=1.35%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验

称取处方药材约25 g，共6份，分别按100%浓度比例加入芦丁对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下方法进行测定，测得总黄酮的平均回收率为98.56%，RSD=1.49%。

2.5 出膏率测定

精密吸取“2.1”项下提取液50 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速称重，计算出膏率。出膏率（%）=

[（W-W1）×V÷（M×50）]×100%。式中，W1为蒸发皿质量，W为浸膏与蒸发皿总质量，V为提取液体积，M为称样量。

2.6 提取工艺条件考察

2.6.1 试验设计

采用L9（34）正交试验法，在单因素优选的基礎上，根据影响一枝蒿酮酸、绿原酸、盐酸伪麻黄碱和总黄酮含量及出膏率的主要因素，选取提取次数（A）、加醇量（B）、提取时间（C）作为考察因素，各因素选取3个水平，正交试验方案见表1。

2.6.2 试验安排与结果

按处方比例称取各药材，按表2安排进行提取，过滤，滤液加相应溶剂稀释至2 L，摇匀，备用。取醇提液适量，分别测定一枝蒿酮酸、绿原酸、盐酸伪麻黄碱和总黄酮含量及浸膏得率，采用综合评分法对结果进行方差分析。综合评分=一枝蒿酮酸含量÷一枝蒿酮酸最大含量×0.2+绿原酸含量÷绿原酸最大含量×0.3+盐酸伪麻黄碱含量÷盐酸伪麻黄碱最大含量×0.2+总黄酮含量÷总黄酮最大含量×0.2+出膏率÷最大出膏率×0.1。直观分析见表2，方差分析见表3。

由直观分析可知，三因素的主次顺序为A>C>B。由方差分析可以看出，A因素对其提取率有显著影响（P<0.01），B因素和C因素对提取率无显著影响（P>0.05）。

结合生产实际和吸水率结果，从节能省时的角度考虑，最终确定最佳提取工艺条件为A3B1C1，即处方比例药材加60%乙醇加热回流提取3次，第1次12倍量，第2、3次各10倍量，每次1 h。

2.7 验证试验

按处方比例称取药材3份，按上述最佳提取工艺条件平行制备3份样品，测定指标成分含量，结果见表4。测定结果与正交试验结果接近，表明该工艺稳定可靠。

3 讨论

3.1 色谱条件选择

采用HPLC测定绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱含量时，尝试了多种色谱系统，曾采用甲醇（A）- 0.2%磷酸水溶液（B）梯度洗脱同时测定绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱，但图谱中仅绿原酸和一枝蒿酮酸出峰，而盐酸伪麻黄碱未出峰，因此改用乙腈-0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）系统进行测定。由图1可知，绿原酸、一枝蒿酮酸和盐酸伪麻黄碱的峰形对称，分离度佳。最终选用此流动相测定复方芩蒿滴鼻剂中绿原酸、一枝蒿酮酸和盐酸伪麻黄碱的含量，其优势突出，用同一种流动相在不同波长处可同时测定绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱的含量，操作简便、重复性好、节省大量实验时间。

3.2 乙醇浓度考察

本课题组采用单因素试验对提取工艺中的乙醇浓度（0%、20%、40%、60%、80%、95%）进行考察，分别以绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱、总黄酮含量和出膏率为指标，综合考察其提取工艺，结果见表5。综合各考察指标结果，最终选定60%乙醇为提取溶媒。

3.3 综合评分加权系数的确定

由于组成复方的药味较多且成分复杂、指标成分多，对于复方的提取工艺而言，选择合适的指标成分尤为重要。本研究根据芩蒿滴鼻剂对治疗急、慢性及过敏性鼻炎的活性成分重要程度，确定5项指标的优先顺序为：绿原酸>一枝蒿酮酸=盐酸伪麻黄碱=总黄酮>干浸膏。采用综合评分法对各成分进行系数加权，以加权后的综合评分为因变量，不仅能全面反映各味药在整体制剂中的作用，也能直观地反映整体提取工艺。

3.4 工艺参数的确定

本试验以绿原酸、一枝蒿酮酸、盐酸伪麻黄碱、总黄酮含量和出膏率为考察指标，优选出芩蒿滴鼻剂的最佳提取工艺：用60%乙醇加热回流提取3次，第1次12倍量，第2、3次10倍量，每次1 h。验证试验结果表明，优选出的工艺重现性好，工艺稳定可靠，适合大生产需要，可作为该制剂合理开发的依据。

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