一测多评法测定黄蛭内异胶囊中5种蒽醌类成分含量

2018-07-12徐冲沈洁夏敏杨敏冷静

中国中医药信息杂志 2018年4期

徐冲　沈洁　夏敏　杨敏　冷静

摘要：目的采用一测多评法对黄蛭内异胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌类成分进行含量测定，并与外标法进行比较，确定一测多评法对该制剂质量控制的应用价值。方法采用Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（85∶15），流速1.000 mL/min，检测波长440 nm，柱温30 ℃，以大黄素为内参物建立各成分相对校正因子，计算各成分含量。结果以校正因子计算所得各成分含量与外标法实测结果无明显差异，相对误差均小于5%。结论一测多评法可用于黄蛭内异胶囊的质量控制，方法有效可靠。

关键词：一测多评法；黄蛭内异胶囊；蒽醌类；含量测定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.014

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0066-05

Abstract： Objective To determine the contents of 5 anthraquinones （aloe-emodin， phein， emodin， chrysophanol， physcion） in Huangzhi Neiyi Capsule through a quantitative analysis of multi-component by single-marker （QAMS）， To determine the application value of QAMS by comparing with external standard method （ESM）. Methods HPLC was performed at 30 ℃ with Waters Symmetry C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， methanol-0.4% phosphoric acid （85：15） as mobile phase at the wavelength 440 nm， and flow rate of 1.000 mL/min. The relative correction factors of other anthraquinones were calculated respectively by emodin as the reference. Results The values calculated by QAMS were compared with the values measured by ESM， and no significant difference was showed （RSD<5%）. Conclusion For the availability and reliability， QAMS can be applied for quality evaluation of Huangzhi Neiyi Capsules.

Keywords： quantitative analysis of multi-component by single-marker； Huangzhi Neiyi Capsules； anthraquinones； content determination

中药复方制剂具有成分复杂、靶点多样的特点，因此，单一成分的含量检测难以全面体现其整体质量，而多指标的质量控制方法又存在着对照品供应不足问题，限制了中药制剂的质量评价研究。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single- marker，QAMS）是指在建立多指标质量控制方法时，以某一代表性成分（廉价、易得、有效）作为内标物，建立该内标物与其他成分间的相关关系，得出相对校正因子，并利用该因子计算出其他组分的含量[1-2]。QAMS基于多指标质量控制的研究思路，符合中医强调整体治疗的理论，在降低检测成本的同时，解决了对照品供应不足的问题，是当前较具可行性的中药质量控制手段[3-7]。

黄蛭内异胶囊系由重庆市名中医夏敏主任中医师经验方开发而成的医院制剂，主含熟大黄、制香附及水蛭等，具有助肝行气、活血化瘀、祛瘀止痛功效，临床用于治疗子宫内膜异位症。为更好地控制黄蛭内异胶囊的质量，本研究采用QAMS对制剂中的有效成分大黄蒽醌类进行含量测定，并将计算值与外标法（ESM）实测值进行比较，验证QAMS评价该制剂质量的适用性与可行性。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），XA205DU电子天平（Mettler Toledo），JA3003J电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），AS10200AT超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

芦荟大黄素对照品（纯度99%，批号P1170093），Admas Reagent；大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚对照品（批号分别为110757-200206、110756- 201512、110796-200716、110758-201415），中国食品药品检定研究院。黄蛭内异胶囊（批号160606、160607、160704、160705、160718、160815、160816、160817），本院中药制劑室自制。甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（85∶15），流速1.000 mL/min，柱温30 ℃，检测波长440 nm，进样量10 μL[8-11]。

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品5.35、5.29、5.42、5.08、5.38 mg，加甲醇制成混合对照品溶液，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度分别为0.053 5、0.052 9、0.054 2、0.050 8、0.053 8 mg/mL。

2.3 供试品溶液的制备

取黄蛭内异胶囊（批号160607）内容物研细（过4号筛），精密称取细粉0.5 g，加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，冷却后再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤。精密量取续滤液20 mL，水浴蒸干，加入8%盐酸溶液10 mL，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）2 min后加入三氯甲烷20 mL，加热回流1 h，放冷，置于分液漏斗，用少量三氯甲烷洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层（10 mL×3），合并，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，定量至10 mL量瓶，摇匀，过滤，取续滤液，即得[12]。

2.4 阴性对照溶液的制备

根据黄蛭内异胶囊处方组成，制备缺大黄的阴性样品，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 专属性试验

分别吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，结果各色谱峰分离度良好，色谱图见图1。

2.6 线性关系考察

分别吸取混合对照品溶液5、10、15、20、25、30 μL注入高效液相色谱仪中，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，進行线性回归，结果见表1。

2.7 精密度试验

精密吸取同一批号黄蛭内异胶囊供试品溶液10 μL，连续进样6次，在上述色谱条件下测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积RSD分别为0.46%、0.50%、0.34%、0.49%、0.39%，表明仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验

取同一批号供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、8、16、24 h，精密吸取10 μL，在上述色谱条件下测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积RSD分别为0.26%、0.21%、0.15%、0.25%、0.15%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验

取同一批号黄蛭内异胶囊内容物0.5 g，平行6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备，分别进样10 μL，测得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为0.270%、0.139%、0.785%、0.116%、0.213%，RSD分别为2.43%、2.59%、3.75%、2.12%、2.50%，表明该方法的重复性良好。

2.10 加样回收率试验

精密称取上述批号黄蛭内异胶囊内容物9份，每份约0.25 g，随机分为3组，每组按照内容物含量的80%、100%、120%比例分别加入芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品溶液，加甲醇补足至50 mL，按“2.3”项下方法处理，分别精密进样10 μL，根据峰面积计算加样回收率及RSD。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的加样回收率分别为99.5 %、95.7%、99.1%、97.0%、97.8%，RSD分别为1.28%、0.80%、1.48%、0.40%、1.08%，表明该方法的准确度良好。

2.11 相对校正因子与相对保留值的测定

分别吸取“2.2”项下混合对照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，测定各成分的峰面积及保留时间，并分别计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚与内参物大黄素的相对校正因子及相对保留值，结果见表3、表4。相对校正因子f大黄素/芦荟大黄素=1.010，f大黄素/大黄酸=1.334，f大黄素/大黄酚=0.920，f大黄素/大黄素甲醚=1.118，相对保留值r大黄素/芦荟大黄素=2.197，r大黄素/大黄酸=1.437，r大黄素/大黄酚=0.747，r大黄素/大黄素甲醚=0.651，各成分相对校正因子及相对保留值的RSD均小于5%，表明QAMS建立的方法所得检测结果准确可靠，可用于对黄蛭内异胶囊中所含的大黄蒽醌类成分进行含量测定。

2.12 外标法与一测多评法测定结果比较

取8批黄蛭内异胶囊，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别吸取大黄蒽醌类对照品与供试品溶液，在上述色谱条件下进行含量测定，采用ESM与QAMS分别对黄蛭内异胶囊中的5种大黄蒽醌类成分进行相关计算[13-15]，结果见表5、表6。可见，各成分色谱峰定位比较与含量测定结果比较的相对误差均小于5%，说明QAMS对于检测黄蛭内异胶囊中大黄蒽醌类成分含量具有较高的准确性，可以被用作含量测定的方法。

3 讨论

本试验采用QAMS对黄蛭内异胶囊中5种大黄蒽醌类成分进行了含量测定。通过文献调研，考察了254 nm和440 nm检测波长[9，12]，发现在254 nm检测波长处，样品色谱图杂质峰较多，而在440 nm波长处杂质峰少且阴性对照无干扰，故选择440 nm作为检测波长。

在同时测定大黄多指标成分时，由于芦荟大黄素对照品不易获得，常导致含量测定无法及时实施。而采用本研究所建立的QAMS方法，选用价廉、质稳、易得的大黄素作为内标物，减少了对照品的种类和用量，在对照品缺乏的情况下也可方便有效地对其他4种蒽醌类成分（大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素）进行定量。且本研究结果显示，QAMS测定所得含量结果与ESM测定结果基本一致，色谱峰定位亦准确，说明该方法能够实现对黄蛭内异胶囊中多成分质量控制的目的，在节省成本的同时极大增加了检测的便利性，具有较高的应用价值。

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