辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对脂多糖诱导内毒素血症小鼠生化指标和炎性细胞的影响

谷俐媛　陶俊宇　吴苑滢　宋漫玲　胡庭俊

摘要：目的 觀察辣蓼黄酮乙酸乙酯（FEA）部分对内毒素血症小鼠生化指标和炎性细胞的影响，探讨其作用机制。方法 采用酶解-超声偶联法提取辣蓼全草中总黄酮，结合大孔树脂纯化富集获得辣蓼黄酮乙酸乙酯（FEA）部分，脂多糖（LPS）刺激小鼠建立内毒素血症模型。实验小鼠分为空白组、模型组和FEA高、中、低剂量组，各给药组给予相应浓度药液。测定肠组织丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的含量，肝组织总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，血清还原型谷胱甘肽（GSH）含量与溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）的活性，RT-PCR检测肺组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素（IFN）-α、IFN-γ和白细胞介素-2（IL-2）含量。结果 与空白组比较，模型组小鼠肠组织MDA、MPO和血清ACP水平升高，肝组织T-AOC、T-SOD、GSH-Px和血清GSH、LZM水平降低，血清、肠组织和肝组织TNF-α升高，肺组织TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表达升高；与模型组比较，FEA各剂量组小鼠肠组织MDA、MPO和血清ACP水平降低，FEA中、高剂量组肝组织T-AOC、T-SOD、GSH-Px和血清GSH、LZM水平升高，FEA各剂量组小鼠血清、肠组织和肝组织TNF-α含量显著降低，肺组织TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表达显著降低；FEA高剂量组较模型组小鼠肺组织、回肠和结肠病理形态明显改善。结论 FEA部分能降低LPS诱导小鼠内毒素血症的炎性损伤，对机体具有保护作用。

关键词：辣蓼；黄酮乙酸乙酯；内毒素血症；生化指标；炎性细胞；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.009

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0040-06

Abstract： Objective To observe the effect of flavonoids ethyl acetate （FEA） from Polygonum hydropiper L. on biochemical indexes and inflammatory cytokines in mice with endotoxemia； To expore the mechanism. Methods Total flavonoids in the whole plant of Polygonum hydropiperum L. were extracted by enzymolysis-ultrasonic coupling method. The FEA part were obtained by extracting and separating， followed with macroporous resin purification and enrichment. The animal model of endotoxemia was established by stimulation of lipopolysaccharide （LPS） in mice. Experimental mice were divided into blank group， model group， FEA high-， medium-， and low-dose groups. Each administration group was given the corresponding concentration of herb liquor. The concentration of malondialdehyde （MDA） and myeloperoxidase （MPO） in intestinal tissue， total antioxidant capacity （T-AOC）， superoxide dismutase （T-SOD） activity and glutathione peroxidase （GSH-Px） activity in liver tissue， glutathione （GSH）， lysozyme （LZM） and acid phosphatase （ACP） in serum were determined. The contents of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interferon （IFN）-α， IFN-γ and interleukin-2 （IL-2） in lung tissue were detected by RT-PCR. Results Compared with blank group， the levels of MDA， MPO in intestinal tissue and serum ACP of model mice were increased， while T-AOC， T-SOD， GSH-Px in liver tissue， serum GSH and LZM levels were decreased； TNF-α in serum， intestinal and liver tissues were increased， the expressions of TNF-α， IFN-α， IFN-γ and IL-2 mRNA in lung tissue were increased. Compared with the model group， the levels of MDA， MPO in intestinal tissue and serum ACP were decreased in all dose of FEA groups； The levels of T-AOC， T-SOD， GSH-Px in liver tissue， serum GSH and LZM of FEA medium and high-dose groups were increased. The content of TNF-α in mice serum， intestinal and liver tissues of all dose of FEA groups were significantly reduced， and the expressions of TNF-α， IFN-α， IFN-γ and IL-2 mRNA in lung tissues were significantly decreased. The pathological morphology of mice lung， ileum and colon tissues of FEA high-dose group were significantly ameliorated than model group. Conclusion FEA can attenuate inflammation injury of endotoxemia mice induced by LPS， which has protective effects for organism.

Keywords： Polygonum hydropiperum L.； FEA； endotoxemia； biochemical index； inflammatory cell； mice

辣蓼是蓼科蓼属一年生草本植物，被广泛用于慢性鼻炎、皮脂腺囊肿的治疗，其抗氧化成分主要为黄酮苷类成分异槲皮苷和黄酮苷元类成分槲皮素[1]。内毒素血症由革兰阴性菌感染引起，以败血性休克为标志，常伴发脑、心、肾、肝脏等重要器官的衰竭[2]。革兰阴性菌感染时脂多糖（LPS）的释放会引起肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）-1β等初级炎症因子的释放。有研究表明，在内毒素血症早期抑制此类因子能有效缓解炎症[3]。黄酮类药物凭借其显著的抗炎与抗氧化功效、低毒易得的特点，近年来引起广泛的关注与应用[4]。但关于辣蓼总黄酮对内毒素血症保护效果的研究尚未见报道。

本研究采用酶解-超声偶联法提取辣蓼全草中的总黄酮，经萃取分离杂质，结合大孔树脂纯化富集获得辣蓼黄酮乙酸乙酯（FEA）部分。前期研究表明，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）受到LPS刺激12 h内活性氧（ROS）与一氧化氮（NO）的释放急剧增多，但经FEA处理后1 h能明显减少LPS诱导的ROS释放量；在FEA预处理1 h后能减少LPS刺激所诱导的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的释放，有助于降低炎症损伤；此外，FEA预处理1 h后能增加抗炎因子IL-10的生成[5]。为了进一步考察FEA的体内抗炎效果，本实验采用LPS刺激小鼠建立内毒素血症小鼠模型，观察FEA部分对LPS诱导内毒素血症小鼠生化指标和炎性细胞的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雄性昆明种小鼠80只，5～6周龄，SPF级，体质量18～22 g，廣西医科大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（桂）2014-0002。饲养于温度22～25 ℃、湿度50%～80%环境，自由摄食饮水。

1.2 药物

FEA部分，广西大学动物科学技术学院药理实验室提取。

1.3 主要试剂与仪器

LPS（大肠杆菌055：B5，批号011M4001V），胰酶（批号031M7358V），SIGMA；还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、髓过氧化物酶（MPO）、总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所；超纯RNA提取试剂盒，康为世纪公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量PCR染料，TAKARA公司；EnSpire多功能荧光酶标仪，PerkinElmer公司；实时定量PCR仪（BIO-RAD公司，型号CFX 96），纯水系统（MERCK MILLIPORE公司，型号Direct-Q 5UV），ZT-12M生物组织自动脱水机、YB-6LF型生物组织石蜡包埋机、YT-7FB生物组织摊烤片机，孝感市亚光医用电子技术有限公司；轮转式切片机（型号RM2245），徕卡纤维系统贸易有限公司；微量离心机（型号5418），Eppendorf公司；制冰机，SANYO公司。

2 实验方法

2.1 分组和给药

适应性饲养3 d，80只小鼠随机分为空白组、模型组和FEA高、中、低剂量组，每组16只。FEA高、中、低剂量组分别按200、100、50 mg/kg剂量灌胃FEA部分溶液0.2 mL，模型组灌胃LPS（17 mg/kg）溶液0.2 mL，空白组灌胃双蒸水10 mL/kg，每日1次，连续3 d，最后1次给药1 h后，空白组腹腔注射0.9%氯化钠10 mL/kg，其余各组腹腔注射LPS溶液（17 mg/kg）0.2 mL，24 h后眼球采血并处死，分离受试小鼠肺、小肠、肝组织待测。

2.2 生化指标和炎症因子测定

取小鼠小肠组织，用冰生理盐水制备10%回肠组织匀浆液，严格按照试剂盒说明书测定肠组织匀浆MDA含量和MPO活性，并用考马斯亮蓝试剂盒测定其总蛋白含量。取肝组织匀浆上清液，严格按照试剂盒说明书测定肝脏组织匀浆T-AOC、T-SOD、GSH-Px的活性，并用考马斯亮蓝试剂盒测定其总蛋白含量。

取小鼠血清，严格按照试剂盒步骤测定血清GSH含量及LZM、ACP活性。ELISA试剂盒测定血清、肠组织匀浆及肝组织匀浆TNF-α含量。

2.3 组织病理学观察

取小鼠右肺及回肠、结肠各1～2 cm，福尔马林固定，其余肠组织于-80 ℃冰箱保存备用，4%甲醛溶液固定，石蜡切片，常规HE染色，光学显微镜下观察肠组织病理学变化。

2.4 RT-PCR检测肺组织肿瘤坏死因子-α、干扰素-α、干扰素-γ和白细胞介素-2基因表达

取分离所得的肺组织，按试剂盒说明书提取RNA进行反转录，对目的基因与内参基因分别用实时定量PCR仪和荧光定量PCR仪进行PCR扩增，反应体系严格按PCR仪说明书进行操作。引物序列见表1。

3 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析，多重比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般状况

小鼠注射LPS后8 h，扎堆蜷缩，摄食量减少或停止，12 h后各给药组和模型组出现腹泻现象且模型小鼠开始出现死亡。结果见表2。

4.2 辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对模型小鼠肠组织丙二醛含量和髓过氧化物酶活性的影响

与空白组比较，模型组小鼠肠组织匀浆MDA含量、MPO活性显著升高（P<0.01）；与模型组比较，FEA中、高剂量组小鼠肠组织匀浆MDA含量显著降低，FEA各剂量组肠组织匀浆MPO活性显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表3。

4.3 辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对模型小鼠肝组织总抗氧化能力、总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

与空白组比较，模型组小鼠肝组织匀浆T-AOC水平降低但差异无统计学意义（P>0.05），T-SOD、GSH-Px水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，FEA中、高剂量组小鼠肝组织匀浆T-AOC水平显著升高，FEA各剂量组小鼠肝组织匀浆T-SOD、GSH-Px水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表4。

4.4 辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对模型小鼠血清还原型谷胱甘肽、溶菌酶和酸性磷酸酶活性的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清GSH、LZM活性降低但差异无统计学意义（P>0.05），ACP活性显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，FEA中、高剂量组小鼠血清GSH、LZM活性显著升高，ACP活性显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表5。

4.5 辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对模型小鼠血清、肠组织和肝组织肿瘤坏死因子-α含量的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清、肠组织和肝组织TNF-α显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，FEA各剂量组小鼠血清、肠组织和肝组织TNF-α含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见图1。

4.6 辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对模型小鼠肺组织肿瘤坏死因子-α、干扰素-α、干扰素-γ和白细胞介素-2基因表达的影响

与空白组比较，模型组小鼠肺组织TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，FEA各剂量组小鼠肺组织TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图2。

4.7 辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对模型小鼠肺组织病理形态的影响

模型组较空白组小鼠肺泡壁明显增厚，FEA各剂量组较模型组小鼠肺泡壁增厚现象减轻，FEA高剂量组效果最好。模型组较空白组小鼠肺组织有大量中性粒细胞浸润，并有大面积渗出液漏出，肺毛细血管充血、出血，FEA高剂量组较模型组小鼠肺组织渗出液漏出现象减轻，中性粒细胞未减少。结果见图3。

4.8 辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对模型小鼠回肠组织病理形态的影响

空白组小鼠回肠组织结构完整，可见完整的绒毛；模型组小鼠回肠组织结构出现很大程度的破坏，黏膜下层变薄，存在绒毛大量脱落的现象；FEA高剂量组小鼠回肠组织结构完整，与空白组比较无明显差异。结果见图4。

4.9 辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对模型小鼠结肠组织病理形态的影响

空白组小鼠结肠组织结构完整，可见完整的绒毛；模型组小鼠结肠组织结构出现很大程度的破坏，黏膜下层变薄，存在绒毛大量脱落的现象；FEA高剂量组小鼠结肠组织结构完整，可见完整的绒毛，与空白组比较无明显差异。结果见图5。

5 讨论

黄酮具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化性等作用。有研究表明，腹腔注射槲皮素与黄豆苷元能显著降低血中TNF-α水平，从而降低LPS诱导的败血症肺损伤[6-7]。本实验结果显示，FEA通过提升小鼠体内肝脏抗氧化防御酶促体系的活性可降低LPS对小鼠机体的损伤；抑制LPS诱导的小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的产生，降低肺组织TNF-α、IFN-α、IFN-γ及IL-2 mRNA的表达，减轻LPS对小鼠组织的损伤尤其是肺組织的损伤。

本实验用FEA预处理3 d，能降低LPS对小鼠回肠与结肠的结构损伤，降低LPS刺激下肠道MDA的生成，从而降低氧化应激损伤。肠组织MPO在肠组织局部含量的升高可反映中性粒细胞浸润的程度。FEA预处理后MPO含量的降低表明肠道中性粒细胞浸润现象减少。SOD是清除氧自由基的重要酶系，对细胞损伤具有保护作用，可阻止氧化自由基链式反应扩大，是生物体内氧自由基清除系统的重要防线。FEA预处理能显著提升小鼠肝脏T-SOD水平，提高小鼠肝脏总T-AOC，对抗LPS诱导的氧化应激。有研究表明，给予抗氧化剂或提升机体抗氧化力有助于降低败血症损伤，在LPS诱导的猪与大鼠败血症模型中，N-乙酰半胱氨酸的抗氧化与降低败血症损伤功效已被证实，提示在败血症病程中降低氧化损伤有助于提高动物存活率[8-9]。GSH不仅能消除机体自由基还可以提高机体免疫力，作为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基。有研究显示，运用还原型谷胱甘肽治疗轮状病毒肠炎合并肝功能异常30例，结果表明疗效可靠，提示GSH能一定程度上缓解肠炎[10]。在本实验中，FEA预处理3 d，一方面提升肝组织GSH-Px活性，另一方面提升血清GSH含量，为清除机体内各处自由基提供物质基础。类似研究也表明，阿魏酸对LPS诱导的大鼠败血症模型可升高GSH-Px、GSH与SOD水平，并降低MDA水平及DNA的损伤[11]。总之，FEA通过提升小鼠体内肝脏的抗氧化防御酶促体系的活性从而降低LPS对小鼠机体带来的损伤。

溶酶体是重要的细胞器，内含多种水解酶如ACP，参与细胞的消化、防御等重要生理过程。模型组小鼠受到LPS刺激，导致ACP过多释放，细胞产生自溶、组织发生变性，而FEA能通过提升机体的抗炎、抗氧化能力，从而降低机体的炎症损伤，这在本实验肺组织、肠组织HE病理观察结果均有体现。

本实验结果表明，模型组肠组织、血清和肝组织TNF-α均显著增加。这种现象一方面利于TNF-α诱导内皮细胞和巨噬细胞释放IL-1β，刺激其他细胞因子的生物合成，形成逐级放大的瀑布样连锁反应，诱导大范围的组织细胞损害；另一方面，这些炎症因子特别是IL-2不仅能促进NK细胞的增殖，还能促使NK细胞产生TNF-α，这就导致机体源源不断的生成TNF-α，发生恶性循环，对肺组织产生较强的毒性作用。FEA预处理3 d能有效降低肠组织、血清和肝组织TNF-α的含量，而肺组织TNF-α、IFN-α、IFN-γ及IL-2 mRNA的表达量也能得到显著抑制。

综上，FEA部分能降低LPS诱导的小鼠内毒素血症的炎性损伤，对机体有一定的保护作用，其具体机制还需进一步研究。

参考文献：

[1] 曾维爱，谭济才，谭琳，等.辣蓼的应用及其功效[J].中国农学通报， 2006，22（8）：369-372.

[2] BONE R C， GRODZIN C J， BALK R A. Sepsis：a new hypothesis for pathogenesis of the disease process[J]. Chest，1997，112（1）：235-243.

[3] WEI Z， ROTH R A， YOUNIS H S， et al. Oxidative stress is important in the pathogenesis of liver injury induced by sulindac and lipopolysaccharide cotreatment[J]. Toxicology，2010，272（1/2/3）：32-38.

[4] 黄红泓，甄汉深.中草药辣蓼近年来的研究进展[J].中国民族民间医药，2013，22（1）：38-40.

[5] 罗文涓，陶俊宇，杨剑，等.辣蓼黄酮对脂多糖诱导下RAW264.7细胞活性氧及炎性因子分泌的影响[J].动物医学进展，2017，38（8）：1-6.

[6] LIAO Y R， LIN J Y. Quercetin intraperitoneal administration ameliorates lipopolysaccharide-induced systemic inflammation in mice[J]. Life Sciences，2015，137：89–97.

[7] PARIDA S， SINGH T U， THANGAMALAI R， et al. Daidzein pretreatment improves survival in mouse model of sepsis[J]. Journal of Surgical Research，2015，197（2）：363-373.

[8] VASSILEV D， HAUSER B， BRACHT H， et al. Systemic， pulmonary， and hepatosplanchnic effects of N-acetylcysteine during long-term porcine endotoxemia[J]. Critical Care Medicine，2004，32（2）：525- 532.

[9] RITTER C， ANDRADES M E， REINKE A， et al. Treatment with N-acetylcysteine plus deferoxamine protects rats against oxidative stress and improves survival in sepsis[J]. Critical Care Medicine，2004，32（2）：342-349.

[10] 柯友建.還原型谷胱甘肽治疗轮状病毒肠炎合并肝功能异常30例[J].中国药业，2009，18（15）：73.

[11] BACANLI M， AYDIN S， TANER G， et al. The protective role of ferulic acid on sepsis-induced oxidative damage in Wistar albino rats[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology，2014，38（3）：774-782.

（收稿日期：2017-07-25）

（修回日期：2017-09-17；编辑：华强）