非小细胞肺癌患者中XAF1的表达及其临床意义

王晓燕

(绍兴市人民医院肿瘤内科，浙江 绍兴 312000)

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，而非小细胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)是肺癌最常见的组织学类型，约占肺癌总数的80%～85%，约75%的患者发现时已处于中晚期。目前对于NSCLC患者的治疗以手术联合放疗、化疗和分子靶向治疗的综合治疗为主，但5年生存率很低[1]。肺癌的发生过程尚不清楚，其中涉及不同基因水平的调控[2]。X染色体相关凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP)是一种凋亡抑制蛋白，而XIAP相关因子1(XIAP associated factor 1，XAF1)是新近发现的XIAP拮抗剂，可抑制XIAP的抗凋亡作用[3-4]。本研究拟探讨NSCLC患者中XAF1的表达，分析XAF1基因的表达水平与临床病理特征的关系，寻求治疗NSCLC新的靶标。

1　资料和方法

1.1一般资料选择2013年6月—2016年12月在我院进行手术治疗的NSCLC患者60例，其中男34例，女26例，平均年龄41.9±6.5岁；均经X线、支气管镜、病理学等检查确诊为NSCLC，术前无放化疗史，患者无手术禁忌症且患者病例、临床资料完整，患者均知情同意，并签署知情同意书。收集60例NSCLC患者的癌组织标本及配对正常癌旁组织标本。

1.2研究方法采用Real-PCR检测XAF1基因mRNA的表达。具体过程如下：采用TRIzol© Plus RNA Purification Kit(购自Thermo Fisher Scientific公司)抽提癌组织和癌旁组织的总RNA，经浓度及纯度检测后反转成cDNA第一链，cDNA第一链的合成根据TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix操作说明(北京全式金生物有限公司)。根据NCBI上XAF1基因的基因序列，采用Beacon designer设计XAF1基因Real-PCR引物，引物序列: XAF1F：5'-GGGGTACCAGATCTCCTCCCTC-3'； XAF1R：5'-GCTCGAGGTCTCCAGCTGCTTG-3'。扩增片段长度为108 bp,以GAPDH作为参考基因，引物序列：GAPDH-F: 5’-CGACGTAGTCTCATCTGACTT-3’, GAPDH-R: 5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTT GA-3’，片段长度为124 bp，引物均由上海美吉生物有限公司合成。Real-PCR 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix(购自北京全式金生物有限公司)，Real-PCR反应在ABI7500荧光定量PCR仪中进行，扩增程序为：95℃预变性2 min, 95℃10 s；56℃20 s；72℃30 s，35cycles，并进行溶解曲线的分析，程序为：60℃1 min; 95℃30 s。采用2法计算癌组织和癌旁组织XAF1基因的相对表达量，Ct= Ct(XAF1基因)- Ct(GAPDH基因)。

1.3 统计学处理以SPSS19.0 统计软件进行分析，XAF1基因相对基因表达量用(x±s)表示，采用配对t检验分析癌组织和癌旁组织XAF1基因的表达差异；采用单因素方差检验分析不同临床病理特征间XAF1基因的表达差异；P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

XAF1基因及GAPDH基因qPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，条带单一，且扩增片段长度与理论大小一致，电泳结果如图1所示。Real-PCR反应的重现性及精密度良好，如图2所示。癌组织XAF1基因的表达量(1.47±0.65)低于癌旁组织XAF1基因的表达量(2.36±0.89)，差异有统计学意义(t=6.418，P<0.0001)。癌组织XAF1mRNA水平在不同年龄、性别、组织学类型之间差异无统计学意义(P>0.05)，高中分化的癌组织XAF1mRNA水平显著高于低分化的XAF1mRNA水平，差异有统计学意义(P<0.05)；随着TNM分期的增加，XAF1mRNA水平也明显降低，同时，淋巴结转移患者的XAF1mRNA水平显著低于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义(P<0.05)；见表1。

a.XAF1基因

b.GAPDH基因图1　qPCR产物琼脂糖凝胶电泳图

图2　XAF1基因(I)及GAPDH基因 (II) qPCR扩增曲线图

临床特征例数XAF1mRNA水平F/tP年龄(岁)>40281.34±0.56≤40321.59±0.611.6550.1035性别男341.51±0.35女261.49±0.280.24490.8074病理类型腺癌211.29±0.79鳞状细胞癌391.42±0.560.6990.5084分化程度高中分化331.67±0.28低分化271.26±0.255.918<0.0001分期I171.59±0.34II281.21±0.18III90.76±0.23IV60.66±0.1235.25<0.0001淋巴结转移有201.03±0.25无401.68±0.338.679<0.0001

3　讨论

NSCLC是最常见的恶性肿瘤之一，随着分子靶向治疗技术和诊断技术的发展，NSCLC的治疗效果得到了一定的提高，但患者5年生存率仍低于20%，复发和转移率仍居高不下。目前关于NSCLC的发病机制并不清楚，探索NSCLC新的肿瘤靶分子一直以来备受关注。

人线粒体转录终止因子3蛋白、高迁移族蛋白B1、卵巢癌构域蛋白酶1等多种肿瘤靶分子被认为与NSCLC的发生密切相关[5-7]。XAF1基因是新近发现的一个XIAP拮抗蛋白，由301aa组成，其结构域中含有7个锌指结构，位于染色体17p13.2位点，在抑癌基因P53的远端3cm处。目前的研究指出，XAF1可诱导干扰素的表达，介导干扰素诱导的细胞凋亡，增强TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡；同时，XAF1可与XIAP结合并抑制XIAP的抗凋亡作用[8]。 XAF1基因的失活与黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、胃肠癌的发生、发展密切相关，在多种癌组织中呈低表达水平，XAF1基因的失活也被认为与肿瘤细胞的耐药性有关[9-11]。

本研究应用Real-time PCR研究XAF1基因在NSCLC患者癌组织和正常癌旁组织中的mRNA水平的表达情况，分析XAF1基因的表达水平与临床病理特征的关系。结果显示XAF1基因在NSCLC患者癌组织的表达水平明显低于正常癌旁组织的表达量，这与原先报道的XAF1基因在黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、胃肠癌的表达水平结果相似[9-10]。进一步的分析结果显示高中分化的NSCLC癌组织XAF1mRNA水平显著高于低分化的XAF1mRNA水平，随着TNM分期的增加，NSCLC癌组织XAF1mRNA水平也明显降低。同时，淋巴结转移NSCLC癌组织患者的XAF1mRNA水平显著低于无淋巴结转移的NSCLC癌组织患者，该结果提示XAF1基因的低表达可能与促进NSCLC的发生、发展有关。目前的研究认为XAF1的抑癌机制可能是涉及到XAF1基因启动子区域的CpG岛甲基化机制、XAF1基因位点的杂合性缺失、调节细胞周期检查点、介导干扰素诱导的细胞凋亡、竞争性抑制XIAP对Caspase-3抑制作用以激活Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性[12-13]。具体原因仍有待进一步研究。

综上所述，XAF1基因在NSCLC患者中呈低水平表达，随着分化程度降低、TNM分期增加及淋巴结转移，XAF1基因的表达水平也逐渐降低。XAF1基因的低表达或缺失可能促进了NSCLC的发生、发展。