hUCMSCs对半乳糖致衰老小鼠心脏保护作用

刘建亚 冯文静 牟婕 安妮娜 王仁萍 毛拥军

[摘要]目的探讨人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）对D半乳糖（Dgal）诱导的衰老小鼠的心脏保护作用及其可能的机制。

方法将24只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和干细胞组，每组8只。对照组颈背部皮下注射灭菌注射用水（5 mL·kg-1·d-1）8周，模型组和干细胞组颈背部皮下注射Dgal（150 mg·kg-1·d-1）8周，至Dgal注射第5周和第7周时，干细胞组分别尾静脉注射1×106个hUCMSCs，对照组和模型组尾静脉注射1×PBS（每只0.2 mL）。采用苏木精伊红染色观察心肌组织病理改变，Western Blot检测热休克蛋白70（HSP70）和血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平，RTPCR检测炎症小体相关基因NOD样受体蛋白3（NLRP3）、白细胞介素18（IL18）、白细胞介素1β（IL1β）mRNA的表达。

结果病理学检查显示，模型组出现心肌组织退行性改变，而对照组和干细胞组无相应改变。模型组心肌组织HSP70和VEGF蛋白表达较对照组显著下降，干细胞组HSP70和VEGF蛋白表达较模型组显著升高（F=9.76、43.87，P<0.05）。模型组心肌组织中炎症小体相关基因NLRP3、IL18、IL1β mRNA表达较对照组显著增加，干细胞组心肌组织中炎症小体相关基因表达较模型组显著下降（F=30.04～44.45，P<0.05）。

结论hUCMSCs能有效缓解Dgal诱导的心脏老化，其机制可能与促进血管新生和抑制NLRP3炎症小体通路有关。

[关键词]间充质基质细胞;脐带;心脏;衰老;NLR家族，热蛋白结构域包含蛋白3;半乳糖

[中图分类号]R329.3

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02018905

衰老是一种正常的生理现象，随着年龄增长，机体出现一系列退行性改变，从而引起一系列疾病，如心血管疾病。在机体衰老的过程中，固有免疫应答被激活，从而产生一种系统性、低水平的慢性炎症，即炎性衰老[1]。炎症小体是由多种蛋白组成的复合体，在机体固有免疫应答和炎症反应中起着重要的作用，其中NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体目前研究最为广泛，它可以促进白细胞介素18（IL18）和白细胞介素1β（IL1β）等炎症因子的成熟和释放，从而引起一系列炎症反应[23]。研究表明，当机体促炎症递质肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素6（IL6）、IL18、IL1β等水平升高时，机体处于一种促炎症状态，引起炎性衰老的发生[4]。热休克蛋白70（HSP70）具有抗炎作用，随着年龄的增长其表达下调，在机体衰老过程中起着重要的作用，现已作为衰老的生物学标志物之一[56]。间充质干细胞具有多向分化潜能，可以延缓大鼠自然衰老引起的心脏老化，改善衰老引起的心功能下降[7]。人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）可以直接从人脐带华尔通胶中获得，具有易于获取和分离、来源丰富、不涉及伦理问题、低免疫原性等优点，现已广泛应用于临床研究[8]。hUCMSCs是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，在一定环境下可以分化成机体内各种细胞，具有促进组织修复与再生、调节免疫应答、促进血管内皮生长因子（VEGF）分泌等生物学作用[910]，有巨大的临床应用价值。D半乳糖（Dgal）可以诱导氧化应激、炎症反应的产生，进而加速机体衰老的进程，尤其是脑、心脏等组织器官的衰老;Dgal致衰老模型具有价格低廉、简单易行、结果稳定等优点，现已被广泛应用于老年病、衰老机制、抗衰老药物筛选等方面的研究[1113]。本研究采用Dgal诱导的心脏老化动物模型，探讨hUCMSCs对衰老小鼠的心脏保护作用及其可能机制，以期为延缓心脏老化提供新的理论依据及干预靶点。现将结果报告如下。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1动物SPF级C57BL/6雄性小鼠24只，8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。小鼠在12 h昼夜循环、室温18～22 ℃、相对湿度40%～60%的条件下，饲养于青岛大学医学部实验动物中心，自由进食饮水。

1.1.2细胞和试剂hUCMSCs由国家干细胞与生物诊疗工程研究中心青岛奥克生物开发有限公司提供;Dgal购自美国Sigma公司，VEGF鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司，HSP70兔单克隆抗體购自Abcam公司，GADPH兔抗多克隆抗体、山羊抗鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体购自武汉伊莱瑞特公司，RIPA裂解液购自上海碧云天公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，ECL显影液购自美国Millipore公司，TRIzol购自美国Life Technologies公司，逆转录试剂盒、PCR Mix购自瑞士Roche公司。

1.1.3主要仪器实验用凝胶成像分析仪购自法国VILBER公司，Western Blot蛋白检测仪购自美国BioRad公司，RTPCR仪购自瑞士Roche公司，热循环仪购自美国Perkin Elmer公司，紫外线分光光度计购自德国IMPLEN公司，荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2实验方法

1.2.1实验分组及处理24只小鼠随机分为对照组、模型组和干细胞组，每组8只。小鼠适应性喂养1周后，对照组给予颈背部皮下注射灭菌注射用水5 mL·kg-1·d-1，模型组和干细胞组给予颈背部皮下注射Dgal 150 mg·kg-1·d-1，连续注射8周。至Dgal注射第5周和第7周，干细胞组尾静脉注射1×106 个hUCMSCs，对照组和模型组尾静脉注射1×PBS（每只0.2 mL）。实验结束后，称体质量、处死动物，留取心脏组织标本。取小鼠心肌组织，用甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，苏木精伊红染色，在光学显微镜下观察。

1.2.2Western Blot检测HSP70和VEGF蛋白表达用RIPA裂解液裂解心脏组织，BCA法测定蛋白质含量，取等量的蛋白进行SDSPAGE凝胶电泳，至溴酚蓝到达分离胶底部，转移至PVDF膜上

（200 mA、110 min），以含30 g/L BSA和50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h，加一抗4 ℃摇床孵育过夜，加二抗室温孵育2 h，ECL显影，用凝胶成像分析仪捕捉图像，Quantity One软件分析条带灰度值。

1.2.3RTPCR方法检测NLRP3、IL18以及IL1β的mRNA表达采用TRIzol法提取各组心脏组织的总RNA，紫外线分光光度法测定并计算提取的总RNA含量及浓度，逆转录获得cDNA。采用RTPCR法检测炎症小体相关基因NLRP3、IL18和IL1β mRNA相对表达量。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，引物序列见表1。RTPCR反应条件：95 ℃、600 s;95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共45个循环;95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，97 ℃、1 s。以βactin作为参照，根据2-△△Ct计算目的基因的相对表达量。

1.3统计学处理

应用SPSS 21.0软件进行统计分析，所得计量资料数据以[AKx-D]±s表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1小鼠一般情况

对照组和干细胞组小鼠精神状态好，行动敏捷，毛发有光泽，皮肤弹性好;模型组小鼠体质量增长缓慢，自主活动减少，行动迟缓，身体略弓起，毛发枯黄且易脱落，皮肤弹性差，精神萎靡。

2.2小鼠心肌组织病理学变化

对照组心肌结构和细胞形态、大小正常;模型组心肌细胞排列紊乱、间隙增大，细胞变大，表现出老化的特征;与模型组比较，干细胞组心肌细胞大小正常、排列规整、间隙变小。

2.3各组小鼠心肌组织HSP70和VEGF蛋白表达比较

模型组小鼠心肌组织HSP70和VEGF蛋白表达较对照组下降，干细胞组HSP70和VEGF蛋白表达较模型组升高，差异有统计学意义（F=9.76、43.87，P<0.05）。见图1。

2.4各組小鼠心肌组织NLRP3、IL18和IL1β mRNA表达比较

模型组小鼠心肌组织中的炎症小体相关基因NLRP3、IL18、IL1β mRNA表达较对照组升高，干细胞组心肌组织中炎症小体相关基因表达较模型组下降，差异有统计学意义（F=30.04～44.45，P<0.05）。见图2。

3讨论

随着年龄的增长，衰老相关性疾病发病率增长迅速，因此延缓衰老的速度，甚至逆转衰老成为目前研究的热点。近年来，Dgal诱导的衰老模型被国内外的学者广泛应用，如神经退行性变模型、心脏老化模型、生殖功能退化模型等[11，14]。在正常情况下，机体可以将Dgal代谢为葡萄糖，然而在过量的情况下，Dgal诱导机体产生过量的氧自由基和糖基化终末产物，后者作用于糖基化终末产物受体，导致炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍和细胞损伤，诱导剂，激活小鼠体内炎症小体通路，引发炎症反应，加速衰老，表现为小鼠体质量增长缓慢、自主活动减少、毛发枯黄、精神萎靡等衰老的特征，另外，心肌组织出现心肌细胞间隙增大、细胞肥大等损伤的病理学表现。尾静脉注射hUCMSCs后，Dgal诱导的机体衰老特征得到改善，心脏组织损伤得到恢复。

HSP70作为衰老的标志物之一，具有抑制炎症反应的作用。HSP70可能是通过抑制IκBα磷酸化，从而抑制NFκB激活下游的TNFα、IL1β、IL6等促炎症因子的释放，抑制炎症反应的发生[5，17]。HSP70还可通过调节全身炎症状态，保护机体脏器不受增龄相关的慢性炎症损伤[18]。VEGF作用于血管内皮细胞，可促进新生血管生成，改善心肌梗死后心脏功能[1920]。hUCMSCs可促进VEGF的分泌，作用于血管内皮细胞，从而促进血管新生，抑制细胞凋亡和坏死的发生[9]。本文研究结果显示，静脉注射hUCMSCs能够上调Dgal诱导的老化心肌组织中HSP70、VEGF蛋白的表达，具有抑制心脏慢性炎症进展、促进心脏血管新生，进而延缓心脏老化的作用。

NLRP3炎症小体在许多慢性疾病中扮演着重要角色，能够引起慢性、系统性炎症以及慢性器官衰竭[21]。有研究表明，Dgal诱导的衰老模型可激活炎症小体通路，引起机体IL18、IL1β等促炎症因子的释放，从而加速炎性衰老的进程，该通路在年龄相关的心血管疾病中亦起着重要的作用[2，22]。研究也表明，移植间充质干细胞可以延缓大鼠自然老化导致的心功能下降[7]，抑制脂多糖活化的NLRP3炎症小体活性，从而抑制因炎症反应引起的损伤[23]。hUCMSCs在适当的条件下可以分化为心肌细胞，参与心脏损伤的组织修复[24]，还可通过旁分泌机制分泌细胞因子，促进受损心脏组织的自我修复[25]。本文研究结果显示，将hUCMSCs通过尾静脉注射到Dgal诱导的衰老小鼠体内，不仅小鼠的衰老特征得到改善，心肌组织中NLRP3炎症小体通路也得到抑制，促炎症因子IL18和IL1β mRNA表达下降，说明hUCMSCs可以改善Dgal诱导的心脏老化，抑制炎性衰老的进展。

综上所述，hUSMSCs可以延缓Dgal诱导的小鼠心脏老化进展，该作用可能是通过促进血管新生、抑制炎症小体通路激活实现的，但其具体的作用机制还有待进一步研究。

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