右美托咪定对大鼠海马神经元细胞低氧复氧损伤中线粒体分裂影响

孙鑫洲　张林　王士雷　李瑜　张殿隆　高清华

[摘要]目的探讨右美托咪定对大鼠海马神经元细胞低氧复氧损伤中线粒体分裂的影响及其机制。

方法

原代培养出生24 h内的SD大鼠海马神经元细胞，采用氧糖剥夺法建立低氧复氧模型，随机数字表法分成8组（n=6）：正常对照组（C组，不对细胞进行处理）、赋形剂组（V组，不进行低氧复氧处理，加入体积分数0.000 1的二甲亚砜培养6 h）、低氧复氧组（H/R组，采用氧糖剥夺法低氧6 h、复氧20 h，建立大鼠海马神经元低氧复氧损伤模型）、H/R+右美托咪定0.1 μmol/L组（D1组）、H/R+右美托咪定1.0 μmol/L组（D2组）、H/R+右美托咪定5.0 μmol/L组（D3组）、H/R+右美托咪定10.0 μmol/L组（D4组）、H/R+右美托咪定100.0 μmol/L组（D5组），D1、D2、D3、D4、D5组在低氧复氧期间分别加入终浓度为0.1、1.0、5.0、10.0、100.0 μmol/L的右美托咪定，低氧6 h，复氧20 h。观察各组海马神经元细胞的数量与形态，检测各组神经元细胞活性、细胞质中的钙离子荧光强度以及线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1和细胞色素C（CytC）、凋亡诱导因子（AIF）的表达。

结果与C组比较，H/R组神经元细胞数量和活性明显降低，钙离子荧光强度、Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表达均增高，差异有显著性（F=221.10～816.00，P<0.05）；V组各指标差异无统计学意义（P>0.05）。与H/R组比较，D1、D2、D3组神经元细胞活性升高，钙离子荧光强度和Drp1、Fis1、CytC、AIF蛋白表达显著降低，其中D2组降低更为明显，差异有显著性（F=221.10～816.00，P<0.05）。

结论右美托咪定能够减轻低氧复氧对大鼠海马神经元细胞的损伤，可能通过抑制线粒体分裂发挥作用。

[关键词]右美托咪定；线粒体；低氧；海马；神经元

[中图分类号]R971.3；R614.24

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02015606

临床麻醉中常出现心脏停搏、休克、手术意外等急危重症情况，易造成大脑缺血/再灌注（I/R）损伤，表现为不同程度的脑功能障碍，具有高发病率、高致残率、高死亡率[1]。对应用麻醉药物时的脑保护研究一直都是临床麻醉探索的热点之一。丙泊酚和异氟烷都可以通过不同的机制减轻大脑I/R损伤[24]。近年来研究发现，线粒体除作为细胞供能的细胞器以外，在细胞凋亡的过程中同样起着重要的作用[5]。研究显示，线粒体处在一个不断分裂/融合的平衡状态，而这种状态的维持与细胞凋亡密切相关。I/R损伤可导致线粒体分裂增加，从而加重细胞凋亡[6]，抑制I/R损伤过程中的线粒体分裂过程，可以有效抑制细胞凋亡。研究显示，右美托咪定可以通过抑制钙离子内流减轻脑I/R损伤[7]，但尚无研究探讨右美托咪定是否可以通过作用于线粒体分裂来减轻脑I/R损伤。本实验旨在探讨右美托咪定对脑I/R损伤过程中线粒体分裂的影响。

1材料和方法

1.1海马神经元细胞培养

出生24 h之内的SD大鼠（由青岛市药检所动物中心提供），用体积分数0.75乙醇消毒，在冰袋上摘取海马组织，用2.5 g/L胰酶消化20 min。加入DMEMF12细胞种植液（美国Hyclone公司）终止消化20 min，用200目滤网对海马细胞的消化悬液进行过滤，然后离心。将获得的海马神经元细胞种植在多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被过的培养瓶之中，加入种植液，放入培养箱（美国Thermo公司）中进行培养。24 h后，将原来的种植液吸出，换成含有NeurobasalA的培养液（美国Gibico公司）。每隔2～3 d根据细胞的生长状况进行换液，培养至第8天。

1.2模型制备及分组

建立海马神经元细胞低氧/复氧模型，以此模型模拟脑I/R损伤过程：将培养至第8天的神经元细胞转移至三气培养箱进行培养，同时用无糖Earles液代替原培养液。培养6 h后，换回原培养条件进行复氧培养20 h。低氧复氧的过程中，在培养液中加入溶于体积分数0.000 1二甲基亚砜（DMSO）的右美托咪定標准品（美国Sigma公司）。将海马神经元细胞按数字表法分成8组（每组6瓶）：正常对照组（C组，不对细胞进行处理）、赋形剂组（V组，不行低氧复氧处理，加体积分数为0.000 1的DMSO培养6 h）、低氧复氧组（H/R组，采用氧糖剥夺法低氧6 h，复氧20 h，建立大鼠海马神经元低氧复氧损伤模型）、H/R+右美托咪定0.1 μmol/L组（D1组）、H/R+右美托咪定1.0 μmol/L组（D2组）、H/R+右美托咪定5.0 μmol/L组（D3组）、H/R+右美托咪定10.0 μmol/L组（D4组）、H/R+右美托咪定100.0 μmol/L组（D5组）。D1、D2、D3、D4、D5组在低氧复氧期间分别加入终浓度为0.1、1.0、5.0、10.0、100.0 μmol/L的右美托咪定，低氧培养6 h，复氧培养20 h。

1.3细胞活性测定

在96孔板中培养神经元细胞。各组海马神经元细胞经相应处理后，移除培养液，用PBS缓冲液冲洗3次，根据细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒说明加入检测溶液，于细胞培养箱中孵育1 h后，用酶标仪检测各组细胞450 nm波长处的吸光度。

1.4细胞质钙离子荧光强度测定

用24孔板爬片培养神经元细胞至第8天，各组细胞经过相应处理后，用Hanks液冲洗3次，根据细胞内钙离子检测试剂盒说明，每孔加入工作液100 μL，避光、37 ℃培养箱中孵育45 min；移除工作液，用Hanks液冲洗细胞3次后，加入Hanks液100 μL，继续避光、37 ℃孵育30 min。然后，移除Hanks液，以40 g/L多聚甲醛固定之后，在细胞爬片上滴入甘油防止猝灭，最后封片，用激光共聚焦显微镜观察钙离子的荧光强度，用Image J软件分析钙离子荧光强度值。

1.5Western blot方法检测线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1和凋亡相关蛋白细胞色素C（CytC）、凋亡诱导因子（AIF）的表达

提取各组海马神经元细胞蛋白，用BCA法检测提取的蛋白浓度。配制相应的分离胶和浓缩胶，对提取的蛋白质分别电泳、转膜2 h，再用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，分别加入兔抗鼠单克隆一抗Drp1（美国Milipore公司，1∶400）、小鼠抗大鼠单克隆一抗CytC（美国Milipore公司，1∶1 000）、兔抗鼠单克隆一抗AIF（美国Milipore公司，1∶1 000）以及小鼠抗大鼠单克隆一抗Fis1（美国Milipore公司，1∶

1 000），4 ℃孵育过夜。大约12 h之后，用PBS洗膜3次，每次约10 min。然后加入相应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG二抗（美国Milipore公司，1∶5 000）孵育2 h，PBS冲洗4次，每次约5 min。化学发光法显色，X线底片曝光，使用Image Pro软件分析结果。以GAPDH为内参，以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.6统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，所得计量资料结果以[AKx-D]±s形式表示，多组间均数比较若满足正态分布以及方差齐性，则采用单因素方差分析，组与组之间两两比较采用LSDt检验；若多组数据间比较时方差不齐，则采用秩和检验，组与组之间两两比较用Wilcoxon秩和检验并用Bonferroni法校正P值。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1各组神经元细胞活性比较

与C组比较，H/R组神经元和突触的数量明显减少；与H/R组比较，D1、D2、D3组神经元和突触数量明显增多，而D4、D5组神经元和突触数量明显减少。C组和V组之间的细胞活性比较差异无显著性（P>0.05）；H/R组的细胞活性明显低于C组和V组，D1、D2、D3组细胞活性明显高于H/R组，而D4、D5组细胞活性低于H/R组，差异有显著性（F=221.10，P<0.05）。见表1、图1。由于D4、D5组右美托咪定处理细胞不但不会产生保护作用，反[LL]而会导致细胞损伤加重，因此后续实验中舍弃了D4、D5组。

2.2各组细胞质钙离子荧光强度比较

V组细胞质内钙离子荧光强度与C组比较差异无显著性（P>0.05）；H/R组钙离子荧光强度与C组相比明显升高，D1、D2、D3组钙离子荧光强度低于H/R组，D2组细胞质内钙离子荧光强度低于D1、D3组，差异有显著性（F=816.00，P<0.05）。见表1。

2.3各组线粒体分裂和凋亡相关蛋白表达的比较

C组和V组比较，Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表达差异无显著性（P>0.05）。与C组比较，H/R组Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表达显著增加；与H/R组比较，D1、D2、D3组Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表达显著降低；其中D2组4种蛋白表达降低最明显，差异有显著性（F=399.20～577.26，P<0.05）。见图2、表2。

3讨论

I/R模型线粒体的形态和结构的作用已经成为右美托咪定神经保护机制体外研究的重点，相关实验初步揭示了右美托咪定可能通过作用于线粒体内部相关结构或是干扰部分因子的释放从而抑制神经元细胞I/R损伤过程中的凋亡[810]。目前，尚没有研究探讨右美托咪定对神经元细胞的保护作用是否与线粒体分裂和融合之间的动态平衡有联系。

本文研究通过培养原代海马神经元细胞采用氧糖剥夺法建立低氧复氧模型，作为大脑I/R损伤体外模型[1112]，探讨右美托咪定对大鼠海马神经元细胞在H/R损伤过程中的作用。本文研究结果显示，0.1～5.0 μmol/L浓度的右美托咪定对海马神经元细胞H/R损伤具有保护作用，尤其1.0 μmol/L浓度右美托咪定的保护作用最明显；随着剂量的加大，当右美托咪定浓度超过10.0 μmol/L时，对神经元细胞的生长出现抑制作用。右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）能够一定程度降低由于H/R损伤导致的线粒体内过高的钙离子荧光强度，对细胞凋亡起到部分抑制作用。对大鼠脑I/R损伤研究显示，右美托咪定可以有效减少神经元细胞的凋亡，其机制为上调抗凋亡蛋白Bcl2的表达，抑制促凋亡蛋白Bax、P53的表達，同时也对线粒体膜的通透性有一

定的降低作用，从而抑制CytC、AIF等凋亡相关因

[LL]子从线粒体释放到胞浆中[1314]。线粒体在细胞凋亡中起着重要作用，研究显示线粒体其实是一个不断进行分裂融合的动态细胞器[1518]，这种动态过程主要表现为分裂和融合处于平衡且对立的状态。线粒体分裂涉及两种蛋白，分别是Drp1蛋白和Fis1蛋白[19]。有研究表明，Drp1 Ser637作为Drp1的磷酸化位点可以被钙离子依赖性的钙调磷酸激酶去磷酸化，从而促进线粒体的分裂[20]。本文研究通过检测线粒体裂变蛋白的表达，探讨右美托咪定抑制H/R诱导的线粒体裂变对神经细胞的保护机制。

[HJ2mm]结果显示，右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）可能通过降低H/R损伤时Drp1和Fis1的表达来抑制线粒体的分裂，对神经细胞发挥保护作用。

线粒体在I/R损伤导致细胞凋亡过程中起着重要的作用，CytC作为呼吸链中的一个重要环节在线粒体凋亡途径中起到非常关键的作用[2122]。AIF作为一种凋亡诱导蛋白，通过对细胞内染色质的浓缩和线粒体膜除极影响细胞凋亡的过程[2324]。右美托咪定可以减少从线粒体释放到细胞质中的CytC

量，抑制细胞中caspase9、caspase3和caspase6的激活，使caspase依赖程序性细胞凋亡受到抑制， AIF的表达也降低[25]。本文研究结果显示， 0.1～5.0 μmol/L浓度右美托咪定可降低CytC和AIF的表达，且1.0 μmol/L浓度右美托咪定是发挥脑保护的最佳浓度。推断右美托咪定可能通过降低Drp1和Fis1的表达来抑制线粒体的分裂，进一步降低CytC和AIF的表达，抑制H/R损伤过程中的细胞凋亡。综上所述，右美托咪定可能通过抑制线粒体分裂减轻低氧复氧对大鼠海马神经元细胞的损伤。

鈣离子在细胞凋亡过程中起着重要的作用，细胞内钙离子超载能够引起线粒体膜电位除极以及线粒体通透性转换孔开放，从而诱导线粒体凋亡的发生[2627]。本课题组先前的研究结果表明，线粒体钙单向转运体（MCU）可以将细胞质内的钙离子转入到线粒体基质中[2829]，通过调节MCU可以降低脑I/R损伤过程中的钙离子的摄取，起到脑保护的作用[30]。本文的研究结果还显示，右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）降低Drp1和Fis1表达的同时伴随着钙离子荧光强度的降低，推测右美托咪定可能是通过抑制胞浆钙超载诱导的线粒体膜电位除极和线粒体通透性转换孔开放，抑制线粒体凋亡 [31]。

虽然右美托咪定对于H/R损伤过程中神经元细胞的凋亡有保护作用，但是，影响线粒体分裂的因素有很多，同时影响钙离子浓度的因素也很多，例如兴奋性氨基酸的产生等。本文仅探讨右美托咪定对于神经元细胞H/R损伤过程中的直接影响，右美托咪定能减轻低氧复氧对大鼠海马神经元细胞的损伤，其机制可能是通过抑制线粒体分裂发挥作用。

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