我院2014—2017年鲍曼不动杆菌的临床分布、耐药性及耐药基因研究

张宇琼 高晶晶 陆文香 张宇蔺 袁垆 徐卫东

中圖分类号 R446.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）06-0794-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.17

摘 要 目的：为临床合理用药与医院感染控制提供参考。方法：收集我院2014年1月-2017年6月检出的鲍曼不动杆菌（AB），采用纸片扩散法和最低抑菌浓度法进行药敏试验。采用聚合酶链反应法对多重耐药鲍曼不动杆菌（MDR-AB）耐药基因进行扩增，并与GenBank数据库进行Blast比对。结果：共检出AB 1 758株，主要来自于痰液及咽拭子标本（65.24%），其次为尿液标本（18.49%）；主要分布于重症医学科（ICU）（38.51%）和呼吸内科（24.00%）。AB对复方磺胺甲噁唑、哌拉西林钠他唑巴坦钠、庆大霉素、头孢吡肟、左氧氟沙星、米诺环素、亚胺培南等大部分常用抗菌药物的耐药率均超过了40%，且有逐年上升的趋势；对黏菌素的耐药率<5%，且逐年下降。共检出MDR-AB 673株，各年度检出率依次为22.77%、29.82%、52.09%、54.33%。110株检测耐药基因的MDR-AB菌株中，TEM、AmpC、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24、OXA-51、aac（6′ ）-Ⅰ、aac（3）-Ⅰ、ant（3″ ）-Ⅰ、anmA、gyrA、parC基因的检出率分别为97.27%、91.82%、49.09%、12.73%、90.91%、12.73%、98.18%、34.55%、60.91%、89.09%、87.27%、77.27%、82.73%。Blast比对结果显示，gyrA基因第83、121位碱基发生点突变，parC基因第144位碱基发生点突变。结论：我院AB主要来自于痰液及咽拭子标本，主要集中在ICU和呼吸内科；耐药情况严重，MDR-AB的检出率逐年升高。多重耐药菌株检出的主要基因包括TEM、AmpC、OXA-23、OXA-51、ant（3″ ）-Ⅰ、anmA等，且gyrA、parC基因存在突变。临床应加大抗菌药物分级使用管理力度，加强AB耐药性监测，并根据药敏试验结果合理选择抗菌药物，防止或延缓AB耐药菌株在医院内定植与交叉传播。

关键词 鲍曼不动杆菌；多重耐药；耐药性；临床分布；耐药基因

ABSTRACT OBJECTIVE： To provide reference for rational drug use in clinic and nosocomial infection control. METHODS： Acinetobacter baumannii（AB） were collected from our hospital during Jan. 2014-Jun. 2017. Drug sensitivity tests were conducted by using K-B method and MIC method. Drug-resistance genes of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii（MDR-AB）were amplified by PCR， and compared with GenBank database by using Blast comparison. RESULTS： A total of 1 758 strains of AB were detected， and mainly came from sputum and throat swab （65.24%）， followed by urine （18.49%）. These infected patients were mainly distributed in the departments of ICU （38.51%） and respiratory medicine （24.00%）， respectively. Drug resistance of clinical isolated AB to most commonly used antibiotics were more than 40%， such as compound sulfamethoxazole， piperacillin sodium and tazobactam sodium， gentamicin， cefepime， levofloxacin， minocycline， imipenem， etc.； it had increased year after year. Drug resistance to colistin was lower than 5% and decreased year by year. A total of 673 strains of MDR-AB were detected， and detection rates were 22.77%，29.82%，52.09%，54.33%， respectively. Among 110 strains of MDR-AB， detection rates of TEM， AmpC， IMP， VIM， OXA-23， OXA-24， OXA-51， aac（6′ ）-Ⅰ， aac（3）-Ⅰ， ant（3″ ）-Ⅰ， anmA， gyrA， parC gene were 97.27%， 91.82%， 49.09%， 12.73%、90.91%， 12.73%， 98.18%， 34.55%， 60.91%， 89.09%， 87.27%， 77.27%， 82.73%， respectively. Results of Blast comparison showed that point mutation occurred in 83rd and 121st base of gyrA gene， 144th base of parC gene. CONCLUSIONS： AB mainly come from sputum and throat swab specimens in our hospital， and infected patients are mainly distributed in the departments of ICU and respiratory medicine. Drug resistance is serious， and the detection rate of MDR-AB is increased year by year. Main genes of multidrug-resistant strains mainly include TEM， AmpC， OXA-23， OXA-51， ant（3″ ）-Ⅰ， anmA， etc.， and mutation of gyrA and parC gene are found. It is necessary to strengthen the management of classification use of antibiotics and strengthen the monitoring of AB drug resistance. According to the results of drug sensitivity test， antibiotics are selected rationally to prevent or delay planting and cross transmission of AB-resistant strain.

KEYWORDS Acinetobacter baumannii； Multidrug-resistance； Drug resistance； Clinical distribution； Drug-resistance gene

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii， AB）生存条件简单，且广泛存在于自然环境中，并可长期定植于人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道等部位，是医院最常见的条件致病菌之一，可引起呼吸道感染、伤口及术后感染、继发性脑膜炎、败血症和尿路感染等[1-2]。住院患者由于免疫力下降、大量应用抗菌药物而导致菌群失调，已成为AB的易感人群，尤其是多重耐药AB（Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii，MDR-AB）；同时，MDR-AB已成为医院内感染爆发流行的重要病原菌，给临床治疗带来很大困难[3-4]。笔者通过收集我院2014-2017年临床分离的AB的病原学资料，回顾性分析其科室分布、耐药性及耐药基因，以期为临床合理用药、医院感染控制提供参考。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集我院2014年1月-2017年6月临床各科室送检标本中分离的AB（剔除同一患者检出的重复菌株）的病原学资料。

1.2 材料

PhoneixTM 100型全自动微生物分析仪（美国BD公司）；Microflex LT型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）（德国Bruker公司）；5804R型离心机（德国Eppendorf公司）；瓊脂糖（美国Sigma公司）；Syngene 1467型紫外凝胶电泳成像仪、T100 Thermal Cycle型扩增仪（美国Bio-Rad公司）；血琼脂平板、麦康凯琼脂平板和M-H琼脂平板均购自郑州安图生物工程股份有限公司；药敏纸片购自英国Oxoid公司；聚合酶链反应（Polymersase chain reaction，PCR）相关试剂（dNTP mixture、10×Ex Taq buffer、Ex Taq酶、6×Loading buffer、DNA Ladder marker）和电泳试剂均购自大连TaKaRa公司；质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）由北京中原公司提供。

1.3 菌株分离、培养、鉴定和药敏试验

菌株的分离、培养参照《全国临床检验操作规程》（第4版）[5]进行。所有菌株均首先采用Microflex LT型MALDI-TOF MS仪进行快速鉴定，然后采用PhoneixTM 100型全自动微生物分析仪进行鉴定与药敏试验。其中，米诺环素和头孢哌酮钠舒巴坦钠的药敏试验采用纸片扩散（Kirby-Bauer，K-B）法，其余均采用最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）法。药敏试验数据采用WHONET 5.6软件进行处理，结果判定参照美国临床与实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）各年的标准。MDR-AB是指对5类抗菌药物（包括氨基糖苷类、β-内酰胺酶抑制剂、头孢菌素类、碳青霉烯类和喹诺酮类抗菌药物）中的3类及以上耐药的菌株[3-4]。

1.4 耐药基因检测

本研究采用简单随机抽样法从2016年分离的MDR-AB中抽取了110株菌株进行耐药基因检测。采用加热裂解法提取MDR-AB的DNA：挑取约5个菌落，加入双蒸水500 μL，混匀，于100 ℃水浴中静置20 min，以20 913×g离心2 min，取上清液，即得模板DNA，置于-20 ℃保存，备用。根据GenBank数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）提供的耐药基因，采用Oligo 7软件（美国Molecular Biology Insights公司）设计引物，部分引物参考相关文献[6-7]。引物（序列见表1）由金斯瑞生物科技有限公司合成。采用PCR法进行扩增。PCR反应体系（20 μL）严格按照PCR相关试剂说明书配制。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s，在各基因类型对应的退火温度下退火60 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。扩增完成后，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外凝胶电泳成像仪上观察，检测菌株相关基因的表达情况。

1.5 基因测序及比对

鉴于AB对喹诺酮类药物的耐药机制[8]，本研究采用简单随机抽样法选取部分敏感菌株和耐药菌株的gyrA和parC基因扩增产物，纯化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。应用Chromas 2.4分析软件（澳大利亚Technelysium公司）读取测序结果，并采用美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）在线分析工具Blast程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对，以确定耐药基因的突变情况。

2 结果

2.1 AB的标本来源

2014-2017年，我院共分离AB 1 758株。所有菌株经Microflex LT型MALDI-TOF MS仪及PhoneixTM 100型全自动微生物分析仪鉴定为AB。AB主要来自于痰液及咽拭子标本（65.24%），其次为尿液标本（18.49%），详见表2。

AB主要来源于重症医学科（Intensive care unit，ICU）和呼吸内科，分别占38.51%和24.00%，详见表3。

2.2 AB的耐药情况

与2014年相比，2015年我院AB对阿米卡星和氨苄西林钠舒巴坦钠的耐药率有所降低，而2016、2017年又迅速上升。AB对复方磺胺甲噁唑、哌拉西林钠他唑巴坦钠、庆大霉素、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、左氧氟沙星、米诺环素、头孢哌酮钠舒巴坦钠、亚胺培南、美罗培南等抗菌药物的耐药率均超过了40%，且有逐年上升的趋势。其中，AB对亚胺培南和美罗培南的耐药率已高达77.5%和78.3%。AB对黏菌素的耐药率最低（耐药率<5%），且逐年下降，详见表4。

2.3 MDR-AB的检出情况

2014-2017年，我院共检出MDR-AB 673株，其每年的检出率依次为22.77%、29.82%、52.09%、54.33%，呈逐年上升的趋势，详见表5。

2.4 MDR-AB耐药基因的检测结果

110株MDR-AB中，有107株检出丝氨酸蛋白酶基因TEM，101株检出头孢菌素酶基因AmpC。金属β-内酰胺类相关耐药基因中，IMP和VIM基因的检出率分别为49.09%和12.73%。苯唑西林酶基因（OXA群）OXA-23、OXA-24、OXA-51的检出率分别为90.91%、12.73%、98.18%。氨基糖苷类修饰酶基因aac（6′ ）-Ⅰ、aac（3）-Ⅰ、ant（3″ ）-Ⅰ、armA的检出率分别为34.55%、60.91%、89.09%、87.27%。喹诺酮类相关耐药基因gyrA、parC的检出率分别为77.27%、82.73%，详见表6。Blast比对结果显示，gyrA、parC均存在基因突变，其中gyrA可见第83位（TCA→TTA）和121位（TGT→CGT）碱基发生点突变，parC可见第144位（AGC→AAC）碱基发生点突变。

3 讨论

AB具有较强的环境适应能力并在自然界中广泛存在，长期住院、免疫力低下以及行气管插管或机械通气的患者更容易被AB感染[9]。我院2014-2017年分离出的革兰氏阴性杆菌中，AB的检出量仅次于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，位居第3位，与国内外文献结果[4，10-11]基本一致，提示AB的流行具有一定的共性。我院AB主要来源于痰液及咽拭子标本（包括上呼吸道标本），其次为尿液和创口分泌物标本，而血液和其他无菌体液标本所占比例较小，提示AB主要引发上呼吸道感染。但值得注意的是，本研究尚无法排除上呼吸道定植菌群的影响，特别是部分没有肺部感染症状却检出AB的患者。因此，临床应树立和强化痰液标本质量控制的意识，送检标本必须来自于实际感染部位，必要时可采集支气管肺泡灌洗液，提高送检标本的合格率；此外，由于痰液标本较易获得，在临床送检标本中所占的比例略高，故为保证微生物检验结果的准确性并正确指导临床用药，应提高血液及其他无菌体液标本的送检比例[12]。

ICU和呼吸内科是AB检出率较高的科室，这与相关文献结果[13-14]相似。这2个排名靠前的科室具有以下共同点：患者多有严重的基础疾病，且长期卧床，并伴有免疫力低下、住院时间长、广泛应用抗菌药物、治疗过程中常需接受气管插管、反复吸氧以及留置导管等高危因素，容易受AB感染并引发交叉感染[3]。已有报道表明，需要持续机械通气或烧伤/创伤患者分离培养出AB的概率更高[9]。

本研究发现，2014-2017年我院AB对大部分常用抗菌药物的耐藥率呈逐年上升的趋势，对头孢菌素类抗菌药物（头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟）的耐药率均超过了50%。耐药率明显升高的抗菌药物包括复方磺胺甲噁唑、阿米卡星、米诺环素，其耐药率分别从2014年的41.3%、40.5%、41.8%上升至2017年的76.6%、73.0%、74.1%。因β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦对不动杆菌属细菌具有直接杀灭作用，故含舒巴坦的复合制剂对不动杆菌具有良好的抗菌活性，可作为联合用药的基础[15]。本研究结果显示，AB对于限制使用级抗菌药物如哌拉西林钠他唑巴坦钠、头孢哌酮钠舒巴坦钠等的耐药率也有逐年上升的趋势；此外，尽管2014-2015年AB对特殊使用级抗菌药如亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为48.6%～57.7%、50.0%～59.2%，低于同期中国细菌耐药性监测网（CHINET）所报道的62.0%～62.4%、66.7%～70.5%[16-17]，但2016年其耐药率均明显上升（69.7%和70.6%），临床应予以高度重视。

本研究结果显示，2014-2017年我院MDR-AB的检出率从22.77%上升至54.33%，笔者认为很可能与碳青霉烯类抗菌药物在我院临床使用率较高有关；另一方面，AB对黏菌素的耐药率从2.8%降至0，可能与临床用药过程中发现该药常致肾脏和神经损害而致临床使用明显减少有关[18]。相关文献表明，AB一旦对碳青霉烯类抗菌药物耐药，则多呈多重耐药或泛耐药，可供选择的抗菌药物也极为有限[19]。因此，临床应正确区分感染与定植，同时加大抗菌药物合理应用的管理力度；对于严重感染者，建议根据药敏试验结果谨慎合理用药，并及时调整用药剂量，以避免或延缓多重耐药或泛耐药菌株的出现。

随着广谱抗菌药物的大量使用，加之AB耐药基因易水平传播，从而导致了MDR-AB的出现[20]。AB的耐药机制复杂，包括多种药物主动外排泵参与介导了β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类及四环素类等多种药物的耐药，耐药基因参与，生成药物灭活酶，抗菌药物作用靶点和外膜通透屏障的改变等[3，21-22]。本课题组前期研究显示，MDR-AB菌株中β-内酰胺类耐药基因（如TEM、AmpC、OXA23等）以及对四环素和复方磺胺甲噁唑耐药的相关基因（如tetA、tetB、mdfA等）均呈高表达，一定程度上反映了AB耐药机制的复杂性[23]。本研究从2016年临床分离的MDR-AB中随机抽取110株菌株（样本量超过当年MDR-AB检出总量的1/3），对其耐药基因进行分析。结果显示，产生β-内酰胺酶是AB对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因。其中，110株MDR-AB中A类丝氨酸蛋白酶基因TEM的检出率为97.27%；B类金属β-内酰胺酶基因IMP、VIM的检出率相对较低，分别为49.09%和12.73%；C类头孢菌素酶基因AmpC的检出率为91.82%；D类苯唑西林酶基因OXA-23、OXA-24、OXA-51检出率分别为90.91%、12.73%、98.18%。这提示AB主要产生A类酶和C类酶，这可能也是导致AB对头孢吡肟、头孢噻肟等β-内酰胺类抗菌药物的耐药率较高的主要原因；同时，D类酶基因OXA-23、OXA-51的检出率也较高，这可能是介导碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要因素[23]；此外，氨基糖苷类耐药基因ant（3″ ）-Ⅰ、armA亦有较高的检出率，可见MDR-AB对氨基糖苷类药物耐药可能与氨基糖苷类修饰酶、16S rRNA甲基化酶有关[24]。有研究表明，AB菌株对喹诺酮类药物耐药主要是由gyrA和parC基因突变所致[8]，故本研究对gyrA和parC基因进行了序列测定与比对。结果显示，喹诺酮类相关耐药基因gyrA、parC的检出率分别为77.27%和82.73%，且均存在突变位点，提示苏州地区（我院同时也是苏州市临床检验中心、苏州市社区卫生临床集中检测中心，检测数据基本能反映苏州地区的病原学特征）AB对喹诺酮类药物耐药与gyrA、parC基因突变有关。

综上所述，我院AB主要来自于痰液及咽拭子、尿液标本，主要分布于ICU和呼吸内科，且耐药情况严重，但对黏菌素敏感。MDR-AB的检出率逐年升高，检出的主要基因包括TEM、AmpC、OXA-23、OXA-51、ant（3″ ）-Ⅰ、armA、gyrA、parC等，且gyrA、parC存在基因突变。医院应加强抗菌药物分级使用管理的力度，减缓耐药菌株产生；临床应合理使用β-内酰胺酶抑制剂复合制剂，慎用碳青霉烯类抗菌药物，联合使用新型抗菌药物如替加环素等[16]；此外，临床还应严格落实手卫生规范，加强环境清洁与消毒，严格执行隔离防护措施，并进行细菌耐药性筛查，从而阻止或延缓AB耐药菌株在医院内定植和交叉传播。本研究虽初步反映了AB耐药机制的多样性，但其菌株耐药基因的来源还有待于进一步探讨，同时也仍需对MDR-AB进行更全面的基因检测，从耐药性与基因表达程度、酶产量、稳定性等方面入手，深入探讨耐药表型与基因型之间的相关性。

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（收稿日期：2017-07-02 修回日期：2018-01-16）

（编辑：张元媛）