响应面法优化咖啡叶中 芒果苷提取工艺的研究

黄丽卿

(1.漳州职业技术学院,福建漳州 363000;2.农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心,福建漳州 363000)

芒果苷具有抗糖尿病及其并发症、抗肿瘤、抗高尿酸血症、调节脂代谢异常、保护心血管和神经、保护肝脏、促进骨骼发育、抗过敏和调节免疫力等广泛的药理作用[1]。

芒果苷不仅存在于芒果树叶片中及其枝条中[2-3],还存在于其它的植物中,如周荣光等[4]报道了芒果苷存在于漆树科扁桃叶中,李开通等[5]通过高效液相色谱(HPLC)法测定不同产地和品种石韦中芒果苷的含量,帅欧等[6]报道了从瑞香科沉香叶中提取芒果苷的工艺,袁叶飞等[7]也研究了川西獐牙菜中芒果苷的提取分离,杨潇等[8]报道了利用超声波提取百合科知母中的芒果苷。

尽管上述文献均提到了以上各植物中芒果苷的提取方法,但值得指出的是,由于咖啡树在我国的云南、海南、广西、广东、福建均有种植[9-10],它作为一种已规模化种植的作物,不仅可以收获高价值的咖啡豆,还可以制作咖啡叶茶[11],与此同时,从本研究的分析发现咖啡叶子中含有丰富的芒果苷(mangiferin),可以用于提取功能成分。由于咖啡叶中芒果苷的提取方法尚未见报道,本研究利用响应面法优化咖啡叶中芒果苷的提取工艺,以期为咖啡叶功能成分分析和深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

咖啡叶 “阿拉比卡”品种,采摘于福建省漳州天绿咖啡(南坑)示范基地,选用咖啡树上墨绿色的叶子,采摘后8 ℃冷藏保存;芒果苷标准品(HPLC≥98%) 上海纯优生物科技有限公司;水 高纯水,实验室自制;甲醇 国产色谱纯;磷酸 国产分析纯。

Waters2998高效液相色谱仪 美国Waters公司;ZB-5斩拌机 华映食品机械有限公司;HH-2恒温水浴锅 金坛市新航仪器厂;AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 咖啡叶中芒果苷的提取工艺 工艺流程:咖啡叶→斩拌机快速斩拌→提取→过滤→测量滤液体积→HPLC法测定滤液中芒果苷的含量。

操作要点:取新鲜的咖啡叶,置于斩拌机内快速斩拌,斩拌成约0.2 cm×40 cm大小的叶片备用。准确称取斩拌后的咖啡叶10 g,置于具塞的三角瓶中,加入乙醇溶液,在恒温水浴锅中加热提取,用300目滤布过滤,测量滤液体积,最后采用HPLC法测定滤液中芒果苷的含量。

1.2.2 芒果苷含量测定

1.2.2.1 芒果苷高效液相色谱的测定条件 色谱柱:Dimaonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),检测波长240 nm,柱温30 ℃,流速1 mL/min,进样量10 μL,以甲醇-0.2%磷酸水溶液(30∶70)为流动相等度洗脱25 min[12]。

1.2.2.2 芒果苷标准曲线的建立 称取芒果苷对照品分别配制0.049、0.098、0.147、0.196、0.245、0.294、0.343 mg/mL的标准溶液,按照1.2.2.1方法操作,以峰面积(A)为纵坐标,进样溶液中芒果苷含量(C,mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线。标准曲线方程为A=21676882C+397632(相关系数r=0.9992),结果表明,芒果苷进样量在0.049～0.343 mg/mL范围内,峰面积与溶液中芒果苷含量呈良好线性关系。

式中:C:滤液中芒果苷含量(mg/mL);V:滤液体积(mL);m:咖啡叶的质量(mg),本实验咖啡叶用量为10 g,即为m=10000 mg。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 料液比 在提取温度65 ℃,提取时间60 min和乙醇浓度60%的条件下,考察不同的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL对咖啡叶中芒果苷提取率的影响。

1.2.4.2 乙醇浓度 在提取温度65 ℃,提取时间60 min和料液比1∶15 g/mL的条件下,考察不同的乙醇浓度55%、60%、65%、70%、75%对咖啡叶中芒果苷提取率的影响。

1.2.4.3 提取温度 在乙醇浓度70%,料液比1∶15 g/mL和提取时间60 min条件下,考察不同的提取温度50、55、60、65、70 ℃对咖啡叶中芒果苷提取率的影响。

1.2.4.4 提取时间 在乙醇浓度70%,料液比1∶15 g/mL和提取温度55 ℃条件下,考察不同提取时间40、50、60、70、80 min对咖啡叶中芒果苷提取率的影响。

1.2.5 响应面实验设计 以单因素实验结果为依据,采用Box-Behnken实验设计及响应面法分析,探索咖啡叶中芒果苷提取的最佳工艺参数[13-14]。以芒果苷提取率为响应值,具体实验设计的因素和水平见表1。

表1 实验设计的因素和水平Table 1 factors and levels of experiment design

1.3 数据处理

采用Origin 8.5软件绘制单因素影响芒果苷提取率的趋势图,采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面设计与分析。

2 结果与分析

2.1 芒果苷对照品和测试品色谱图

芒果苷对照品和测试品色谱图如图1所示。

图1 对照品(A)与测试品(B)色谱图Fig.1 chromatography of the standard substance A and the test products B

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对芒果苷提取率的影响 由图2可知,随着乙醇溶液用量增加,芒果苷提取率也随着迅速提升,当料液比达到1∶15 g/mL时,提取率为0.275%。随着乙醇溶液用量继续增加,芒果苷提取率小幅上升,变化不大。当咖啡叶与乙醇溶液充分接触后,再增加溶剂用量对芒果苷提取率的影响不显著(p>0.05),从提高提取率和降低成本两方面综合考虑,料液比1∶15 g/mL较合适。

图2 料液比对芒果苷提取率的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of mangiferin

2.2.2 乙醇浓度对芒果苷提取率的影响 由图3可知,芒果苷的提取率随乙醇浓度的增加而升高,乙醇浓度为70%时,芒果苷的提取率达到峰值,为0.311%。此后,随着乙醇浓度的增加,芒果苷的提取率降低。有学者指出芒果苷易溶于热的稀乙醇溶液,而当乙醇浓度太高时反而降低其溶解度[6]。因此,乙醇浓度选择70%为宜。

图3 乙醇浓度对芒果苷提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of mangiferin

2.2.3 提取温度对芒果苷提取率的影响 由图4可知,芒果苷的提取率随提取温度的上升而升高,加热温度为55 ℃时,芒果苷的提取率达到峰值,为0.374%。此后,随着温度升高,芒果苷的提取率反而降低。提取温度升高,芒果苷扩散速度加快,溶出增多,提取率升高,但是咖啡叶中成分较为复杂,此外叶片类含有一定量的Mg2+、Ca2+、Cu2+等金属离子,有文献指出芒果苷属于黄酮类化合物,长时间的高温加热容易与溶液中的金属离子形成化合物从而诱导芒果苷的氧化,使芒果苷提取率下降[15]。因此,提取温度选择55 ℃比较合适。

图4 提取温度对芒果苷提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of mangiferin

2.2.4 提取时间对芒果苷提取率的影响 由图5可知,芒果苷的提取率随提取时间的延长而快速增加,提取时间为70 min时,芒果苷的提取率达到峰值,为0.428%。此后,随着提取时间延长,芒果苷的提取率平缓下降。原因可能是长时间的浸提使芒果苷易被共存的酶分解而导致提取率降低[16]。因此,提取时间选择70 min为宜。

图5 提取时间对芒果苷提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of mangiferin

2.3 响应面法优化咖啡叶中芒果苷的提取工艺

表2 实验设计及结果Table 2 Experimental design and results

为检验方程有效性,利用Design-Expert 8.0.6软件对表2中实验结果进一步分析,多元回归模型的方差分析及显著性结果见表3。

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic regression model

2.3.2 响应面分析与优化 利用Design-Expert 8.0.6软件,绘制乙醇浓度、提取温度和提取时间中任何两因素的交互作用对咖啡叶中芒果苷提取率影响的响应面图和等高线图[14],结果如图3所示。

从图6(a、b)可以明显看出,在提取时间为75.76 min的条件下,随着提取温度和乙醇浓度增加,咖啡叶中芒果苷提取率先升高后降低,最高值出现在响应面图6(b)的穹顶位置,在乙醇浓度69%～72%、提取温度55～57 ℃的范围内。

从图6(c、d)可以看出,在提取温度为55.95 ℃的条件下,随着乙醇浓度和提取时间的增加,咖啡叶中芒果苷提取率先升高后降低,最高值出现在响应面图6(d)的穹顶位置,在乙醇浓度68%～72%、提取时间73～78 min的范围内。

从图6(e、f)可以看出,在乙醇浓度为70.15%的条件下,随着提取温度的升高,咖啡叶中芒果苷提取率先升高后降低,但是,提取时间长短对提取率的影响有限。芒果苷提取率的最高值出现在温度55～57 ℃、提取时间73～78 min的范围内。

图6 等高线(a、c、e)及响应面(b、d、f)Fig.6 Contour plot(ace)and response surface(bdf)

2.3.3 最佳提取工艺参数的预测 通过实验模型分析,得出咖啡叶中芒果苷最佳提取工艺为乙醇浓度70.15%,提取温度55.95 ℃,提取时间75.76 min,在预测的最佳工艺条件下,咖啡叶中芒果苷的提取率为0.438%。尽管该数值低于表2中的第14组数据0.4417%,但是由于第14组数据的工艺条件在表2实验中一共重复出现了5次,取其平均值得0.430%,低于预测值,故取预测值的工艺条件作为最优条件。

2.3.4 模型的验证 为便于实际操作,模型验证时工艺条件采用乙醇浓度70%,提取温度56 ℃,提取时间76 min,进行3次平行实验,实验结果是芒果苷提取率的平均值为0.432%,变异系数为 1.39%,实际测定值与理论值(0.438%)相对误差<0.05,说明响应面设计的结果可靠合理。

3 讨论

从植物中提取芒果苷,杨潇[8]等采用超声波辅助提取法从知母中提取芒果苷,提取率可达1.85%;帅欧[6]等以沉香叶为原料,采用回流提取,芒果苷得率达3.31%;邓家刚[3]采用超声波辅助提取法从芒果叶中提取芒果苷,广西不同品种芒果叶和枝条中芒果苷提取率1.51%～8.71%。李开通[6]等采用超声波辅助提取法从石韦中提取芒果苷,产地湖南的光石韦药材芒果苷提取率最高,达3.759%,而有柄石韦和石韦不含芒果苷或含量极低。以上研究所用的原料均为干品,本研究所用原料是新鲜的咖啡叶,水份含量经测定为75.3%,芒果苷的提取率是0.432%,折算成干品,芒果苷的提取率约为1.75%,因此,咖咖叶中芒果苷的含量是相当丰富的。考虑到后续工业化生产的需要,本研究采用醇提方法,可为咖啡叶中芒果苷的进一步开发研究提供了理论依据。但不同产地、品种及不同成熟度的咖啡叶的芒果苷含量不同及不同提取方法对芒果苷提取率的影响等方面有待进一步的研究。

4 结论

针对咖啡叶资源,以确定咖啡叶中芒果苷的最佳提取工艺为目的,在单因素实验的基础上,利用响应面分析法优化提取工艺。确定最佳提取工艺为:料液比1∶15 g/mL、乙醇浓度70%、提取温度56 ℃、提取时间76 min,在此条件下,咖啡叶中芒果苷的提取率为0.432%。