海藻多糖的提取、分离纯化 与应用研究进展

刘 欢,陈胜军,杨贤庆

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海201306)

海藻(Sargassum),海产藻类的统称,通常固着于海底或某种固体结构上,是基础细胞所构成的单株或一长串的简单植物。近年来,随着海藻养殖业的迅速发展,世界上约有50个国家正在进行以海藻占绝大多数(按重量计)的水生植物养殖,其中以海带、麒麟菜、裙带菜、紫菜居多,产量基本上呈逐年增长趋势。根据2016年世界粮农组织报道,2014年全世界共收获了约2850万吨的海藻和其他藻类,用于食品(日本、韩国和中国等)、药品及农业等方面。人们越来越关注一些富含天然维生素、矿物质和植物蛋白的海藻物种的营养价值。海藻口味的许多食品(包括冰淇淋)和饮料在全球有广阔的市场前景[1]。中国作为海藻养殖大国,海藻产品产量由稳步增长到快速增长,到2015年,藻类产品总产量达212.43万吨,海藻产品生产主要集中在福建、山东、辽宁及广东地区。海藻产品以海带为主,约占70%,其他品种占比依次为裙带菜10%、紫菜6%、江蓠13%、其他1%[2]。海藻是一种营养成分丰富的水生植物,主要的活性物质有多酚、多糖、蛋白质、脂类、维生素和矿物质,其中海藻多糖含量最高能达到76%(按干重计)[3],研究价值高。

海藻多糖是从海藻中提取出的多组分混合物,是一种由多个相同或不相同的单糖基通过糖苷键相连而成的高分子碳水化合物,依据来源可分为4大类,即褐藻多糖、红藻多糖、绿藻多糖以及蓝藻多糖[4]。海藻多糖因其凝胶性、稳定性、成膜性等多种特性,以及抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化[5]等多种生物活性,现已成为食品、保健医药及化妆品等领域的研究热点。因此,本文就目前国内外有关海藻多糖的提取、分离纯化以及应用现状展开综述,以期为海藻多糖的进一步开发利用提供参考。

1 海藻多糖的提取

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法包括水提法、酸提法、碱提法等。闵玉涛等[6]用水提法提取海藻多糖,条件为80 ℃、pH7.0、提取10 h,海藻多糖得率可达7.8%。该法经济便捷,操作简便,但需要多次浸提,较其他方法耗时长,所需温度较高,且多糖提取效率低。周裔彬等[7]研究了酸法提取海带多糖的最佳工艺,即:提取温度75 ℃,时间为4 h,料液比为1∶20 (w/v,0.1 mol/L盐酸),最终沉淀所用乙醇的浓度为85%。经测定,多糖得率为35.1%,为传统法(2.98%)的11.78倍。碱提法提取海藻多糖,提取率高于水提法,但是会使多糖活性降低[8]。溶剂提取法是海藻多糖较为常见的提取方法,但具有提取率低、活性损失较大、提取时间长的缺点,限制了海藻多糖的大规模生产。

1.2 物理强化法

物理强化法主要通过物理手段破裂细胞,使细胞内的多糖流出,从而提高多糖得率。主要有微波辅助法、超声辅助法、反复冻融法[9]、高压电脉冲电场提取法[10]等。目前常用的为微波辅助法以及超声辅助法。微波辅助法能明显缩短提取时间,提高效率,并能有效的提高多糖得率。唐志红等[11]用微波法来提取羊栖菜多糖,在最佳工艺参数下水溶性羊栖菜多糖的提取率为15.58%,比热水浸提法提高43.3%,提取时间较传统热水浸提法缩短95.37%。王怀玲等[12]采用单因素考察和正交实验方法优化超声方法提取琼枝麒麟菜多糖(EGP),超声30 min,EGP得率为40.3%±1.8%,为传统热提法的1.4倍。超声法提取海藻多糖具有时间短,工艺稳定,提取率高的优点。总的来说,物理强化法提取海藻多糖,能有效的提高多糖得率,缩短提取时间,节约资源,但由于超声、微波等设备不适用于大规模生产,限制了物理强化法在海藻多糖提取中的发展。

1.3 酶解法

酶解法包括单一酶解法和复合酶解法。Hardouin等[13]用酶解法提取石莼多糖,与空白对照相比,经过酶C4(β-1,3(4)-葡聚糖外切酶)、酶P1(中性内切酶)以及酶P2(中性和碱性内切蛋白酶的复合酶)处理过的石莼,多糖得率分别提高了60%,73%和100%。翟为等[14]以海带为原料,用复合酶(纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、木聚糖酶)法提取海带多糖。在最佳工艺条件下,海带多糖得率为78.9%,较传统工艺提高了近3倍。酶解方法能有效降低提取温度,节能高效等优点。但酶解法提多糖有其局限性,对实验设备的要求较高,同时还需综合考虑酶浓度、底物浓度、抑制剂以及最适pH、温度等因素。

1.4 复合法

将多种方法结合提取多糖,能大大加速多糖的溶出,通过工艺优化达到最优的提取效果。刘杨等[15]研究了超声辅助酸提取、超声辅助碱提取、超声辅助水提取3种方法对雨声红球藻多糖(Haematococcus pluvialis)提取效率的影响。结果表明,3种提取方法所得多糖提取率高低依次为:超声辅助碱提法(9.52%)>超声辅助酸提法(1.50%)>超声辅助水提法(1.29%)。超声辅助碱提法比碱提法(1.55%)的多糖提取率高出近6倍,是一种很好的提取藻类多糖的方法。

超声波与酶解复合法是较为常用的提取多糖方法。超声波协同酶解法提取综合了这两项技术的优点,具有省时、低耗、高产等优点。张丹鹤等[16]研究得到超声波辅助酶法提取马尾藻多糖的最佳条件,实验结果表明,超声波-酶解法提马尾藻多糖,多糖含量明显高于单独酶解法。张胜帮等[17]分别用超声波-酶解法和超声波法提取裙带菜多糖,并比较了这两种方法提取的裙带菜多糖对羟自由基清除活性的作用。结果表明,超声-酶解法的裙带菜多糖提取效果和及其羟自由基清除率能力明显优于超声波法。

2 海藻多糖的分离纯化

在提取海藻多糖的过程中,常有蛋白质、色素等杂质混杂在多糖中,降低了多糖的纯度。因此,先要除去蛋白质、色素以及一些小分子物质。再进行进一步的纯化,对多糖组分进行分级,以提高多糖纯度。

2.1 除杂

海藻粗多糖中常混有蛋白质、色素及一些小分子物质。为了得到纯多糖,需要除去这些物质。除蛋白质常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶法等。除色素的方法主要为活性炭吸附法、离子交换法和氧化脱色法等。对于无机盐、单糖和寡糖等小分子物质,可以采用透析法、超滤法等[18]。其中,透析法操作简便,应用更为广泛。除多糖中蛋白质及色素的主要方法及其优缺点如表1所示。

表1 多糖除蛋白质和色素的主要方法及其优缺点Table 1 Main methods of removing protein and pigment in polysaccharides and their advantages and disadvantages

2.2 进一步纯化

提取、除杂后所得粗多糖通常是混合多糖,若要获得均一性较高的多糖,还需对多糖进行分离纯化。多糖分离纯化的方法有很多,如分步沉淀法、柱层析法、超滤法等,只用一种方法很难得到均一组分,需综合利用几种纯化方法才能达到纯化的效果。

2.2.1 分步沉淀法 多糖的成分结构和分子量不同,其极性大小不同,在有机溶剂(如醇或酮)中的溶解度不同,根据这一原理,可以依此增加醇浓度,从而将多糖按分子量从大到小的沉淀出来[29]。田华[30]通过乙醇分级沉淀,获得6种绳江蓠多糖(GCP),其中,以20%、40%、50%乙醇沉淀得绳江蓠多糖各组分GCP20、GCP40、GCP50收率较高,分别为25%、20%、10%。此法简单易行,一次性处理量较大,关键是找出合适组分的溶剂。

2.2.2 柱层析法 柱层析法,又称色谱分离法。可以分为纤维素柱层析、离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和柱层析等。其中离子交换柱层析和凝胶柱层析应用最为广泛。离子交换柱层析适合于分离各种酸性、中性粘多糖[29],较常用柱填料型号有DEAE-琼脂糖(DEAE-Sepharose)、DEAE-纤维素(DEAE-cellulose)以及DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)[25]。凝胶柱层析则需要根据被分离对象的结构、分子量的大小等综合考虑,选择合适的规格,对于分子量相对较大的多糖常用Sephadex G-100、Sephadex G-200等。离子交换柱层析主要用于将多糖粗提液中的单组份多糖粗分开,通常采用梯度洗脱法。凝胶柱层析用于将离子交换分离得到的复合组分分开或者脱盐[31]。Palaniappan等[32]通过热水浸提法提取尖种礁膜(Monostroma oxyspermum)硫酸多糖,经过阴离子交换和凝胶柱层析,得到的硫酸多糖中含有92%的碳水化合物。

为达到更好的大分子物质纯化效果,新型填料型号DEAE-Sepharose Fast Flow应用于海藻多糖分离纯化,纯化效果良好。同时,树脂化学性质稳定,适于进行大量纯化[25]。彭雍博等[33]以日本厚叶海带(Kjellmaniella crassifolia)多糖为原料,采用DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换柱层析分离纯化,得到5个组分(F-0、F-1、F-2、F-3、F-4),各分离组分峰形相对尖锐且对称,无拖尾现象,分离纯化效果良好,仅F-0为流出峰。

2.2.3 超滤法 超滤法是近年来较常用的高效分离技术,它是以截留不同相对分子质量的超滤膜为分离媒介,以膜两侧的压力差为驱动力,选择性分离不同相对分子质量的多糖,对多糖的生物活性成份破坏小。何芳等[34]采用4种不同截留分子量(MWCO)的超滤膜对条斑紫菜多糖(Pyropia yezoensis Polysaccharide,PP)进行分离,得到分子量分别为PP1(MW≥100 K)、PP2(MW:50～100 K)、PP3(MW:10～50 K)、PP4(MW:5～10 K)和PP5(MW≤5 K)5种不同分子量的多糖,并对5种多糖进行体外抗氧化活性研究。结果表明:MW在5K以下的PP为主要功效成分,开发利用价值较大。刘洪超[35]应用超滤技术(分别为100、50、10、5 K),对羊栖菜多糖进行分离,并对不同分子量段的羊栖菜多糖(SFPS)进行体外抗氧化活性分析,结果表明:不同分子量段羊栖菜多糖均具有较强抗氧化能力,相对分子量越小其自由基清除能力相对越强。

3 海藻多糖的应用

3.1 食品方面

海藻多糖可作为食品供人直接食用,在中国、日本以及南亚各地常以琼脂为食物。中国的南方各地也将海藻多糖胶视为夏季最适宜的清凉食品。随着对海藻多糖研究的深入,海藻多糖的应用领域越来越广泛。海藻多糖因其良好的溶解性、增稠作用、凝胶性、乳化稳定性、安全稳定性等,被广泛的应用于饮料、肉制品、糖果等食品加工中,不仅能够增加食品的功能性,提高营养价值,对于改善食品品质也有积极地促进作用。同时,海藻多糖可以制成可食性食品薄膜,用于食品包装。另外,海藻多糖在食品的涂膜保鲜方面也有广泛的应用。

3.1.1 饮料 目前,许多研究以海藻多糖为原料制备饮料。王秀娟等[36]以海带为主要原材料,采用酶解法提取海带多糖,研制出海带多糖饮料,其最佳配方为:海带多糖提取液浓度50%,柑橘汁浓度10%,柠檬酸浓度0.3%,苹果香精浓度1.5%。陈达妙[37]以浒苔多糖为主原料,配以山楂、枸杞等辅助材料制得的饮料,风味良好、品质稳定,同时,具有较好的调节2型糖尿病大鼠糖脂代谢作用。

另外,海藻多糖作为食品添加剂在饮料加工方面也起着重要的作用。海藻多糖作为食品添加剂在饮料加工方面的主要功能特性如表2所示。

表2 海藻多糖作为食品添加剂在饮料加工方面的功能特性Table 2 Functional properties of seaweed polysaccharides as food additives in beverage processing

3.1.2 肉制品 海藻多糖可以用在火腿、火腿肠、重组肉制品中,在牛肉及鱼肉罐头制品用也有应用。在肉制品中加入海藻多糖,既可以提高肉制品的品质,增加粘度,赋予其良好的口感,又可以增加肉制品的持水性和柔嫩性,减少营养成分和风味物质的损失。

高雪琴[38]将卡拉胶和大豆分离蛋白以及脂肪复合添加到猪肉饼中,对猪肉饼的出品率、保水率、保油率、质构以及感官等指标均有不同程度的提高。代增英等[39]研究了海藻酸盐复配肉制品增稠剂MY-G02对肉丸品质的影响,通过感官品评以及TPA全质构分析,得出MY-G02的最佳添加量为0.3%。

3.1.3 糖果 海藻多糖加入到糖果,可以发挥稳定剂的作用。海藻多糖加入到透明水果软糖中,可以提高糖果透明度,不粘牙。在一般硬糖中加入海藻多糖,可以使糖果均匀光滑。潘晓丽等[40]研制的牛肉软糖,以明胶、琼脂、卡拉胶为主要复合凝胶剂。琼脂糖、无花果糖、棉花糖等产品中都加入一定量的琼脂,增强凝胶性。在制作透明水果软糖时加入卡拉胶,可以起到增加水果香味,甜度适中,提高稳定性的作用[41]。

3.1.4 食品薄膜 海藻多糖具有良好的成膜性,可以用于制备食品薄膜。海藻酸钙能与其他天然高分子聚合物共混,制作食用薄膜,可以改善海藻酸钙凝胶性质[42]。肖茜等[43]利用海藻酸钠与普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠共混制备可食性包装薄膜,该薄膜抗拉强度高、阻氧性强且致密。

3.1.5 食品涂膜保鲜 目前,许多研究证明海藻多糖具有保鲜效果。有研究表明:海带多糖复合溶液(含2%海带多糖,0.4%壳聚糖,0.2%魔芋葡甘聚糖)用于辣椒的涂膜保鲜,效果最好[44]。郭守军等研究表明,与蜈蚣藻多糖与卡拉胶复合涂膜保鲜剂相比,蜈蚣藻多糖涂膜保鲜剂更有利于杨梅的保鲜[45]。Nima等[46]发现,海藻酸钠复合保鲜溶液(12.98 g/L海藻酸钠+0.25 g/L葵花籽油+11.6 g/L甘油+3 g/L柠檬精油),显著抑制了微生物的活性,改善了菠萝的理化性质及感官特性。海藻多糖来源广泛、成本低、安全性高,同时又具有抑菌、抗病毒、抗氧化等活性,是涂膜保鲜技术重要的原材料,在果蔬、肉制品、鱼虾[47]等食品中均有良好的保鲜效果[48]。

3.1.6 其他 海藻多糖加入到冰淇淋中,能提高冰淇淋的黏度及膨胀率,改善其组织状态。海藻多糖在焙烤食品、果冻、乳制品、酱油等产品的生产中也有广泛的应用[49]。

3.2 保健医药方面

海藻多糖具有广泛的药理作用,多样的生物活性,如抗病毒[50]、抗凝血[51]、抗肿瘤[52]、抗氧化[53]等,在保健品行业有广泛的发展前景。在日本,岩藻多糖保健品非常流行。在中国,市面上有一种名为舒通诺的海藻多糖口服液,是新一代逆转血管病变的纯天然海洋生物制品。同时也有一些生物公司出售海藻多糖原料或海藻多糖胶囊用于食品、保健品行业,但是纯度不一,质量参差不齐。

海藻多糖可以应用到植物空心胶囊的制备中。张东[54]研究了海藻酸钠肠溶空心胶囊的制备,并达到药典标准。杜云建等[55]以超低黏度海藻酸钠为主料,羧甲基纤维素(CMC)和卡拉胶组成凝固体系,在最佳优化工艺下,即:溶胶温度为80 ℃,保温时间为60 min,钙化液质量浓度为5%,干燥温度为50 ℃,制备出的胶囊成型性好,胶囊壁厚和脆碎性均符合药用明胶硬胶囊国家标准。

另外,褐藻多糖药物SPMG作为抗艾滋病新药,已经进入了二期临床研究[56]。从海带等海藻中分离提取的海藻酸PPS(藻酸双酯钠)治疗缺血性心血管疾病效果显著,已广泛投入临床应用,但是不良反应有待解决[57]。褐藻多糖硫酸酯是从海带中提取的纯天然药物,通过对其药学、药理和毒理进行系统研究后,完成了二期临床实验,发现它对治疗肾病综合症和早、中期慢性肾衰效果显著[58]。

3.3 化妆品方面

海藻多糖有清除自由基的功效,可以作为抗氧化、抗衰老成分加入到化妆品中。如,浒苔多糖提取物对于ABTS自由基[59]、DPPH自由基和羟基自由基[60]等具有较好的清除能力。有研究表明,浒苔多糖的硫酸化修饰能提高其抗氧化性[61]。海藻多糖可以防辐射[62],可以作为化妆品中的防晒成分,也可以起到抗衰老的作用。海藻多糖具有保湿性。许雷等[63]发现酶解后的褐藻胶寡糖有良好的保湿性和吸湿性。唐小华[64]以贻贝壳粉和裙带菜为原料,研制出贻贝壳海藻多糖面膜,保湿效果显著优于芦荟胶和黄瓜面膜。吴幼青[65]以异枝麒麟菜多糖为原料,设计并制备了一种O/W型多糖膏霜,具有相对稳定、持久的保湿性能。另外,海藻多糖具有降血脂活性,可以添加到减肥制品中,起到瘦身作用。王慧铭等[66]研究了昆布多糖对对大鼠减肥、降血脂的作用,发现昆布多糖对肥胖大鼠具有明显的减肥作用。比较昆布多糖与常用的减肥药赛尼对于小鼠的减肥作用,结果无显著性差异。同时,海藻多糖有抑菌作用[67]等,有望成为治疗痤疮、毛囊炎的化妆品活性成分。

4 展望

我国海藻资源丰富,种类繁多,应用广泛。海藻多糖具有抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、免疫调节等多种功能活性,具有巨大的开发潜力。可以应用现代加工技术,生产出附加值高的海藻多糖食品、保健品以及化妆品,提高人们的生活质量。

虽然,近年来对于海藻多糖的提取、分离纯化以及应用等方面的研究取得了一些成就。但同时,也存在一些问题。如:多糖提取方法众多,各有利弊,但目前仍以热水浸提为主,效率低,时间长;提取及分离纯化的方法的差异,对于海藻多糖的结构以及生物活性的影响尚不明确;海藻多糖结构研究主要集中在单糖组成方面,对于多糖的高级结构研究较少;多糖的活性作用机理及其构效关系尚不明确;海藻多糖的应用方面还有待拓展;对于海藻多糖的生物活性的研究很多,但主要以体外实验为主,缺乏体内实验以及临床研究。这些都是海藻多糖研究未来要面临的挑战。

未来海藻多糖产业可以加强以下几个方面的研究。首先,应用两种及其以上的方法,提取海藻多糖,提高多糖的提取率。同时,要加强海藻多糖结构的研究,确定具有生物活性的多糖结构,为食品、保健医疗等行业的应用提供有力参考。另外,海藻多糖种类繁多,分子修饰在海藻多糖的分子修饰研究已经逐渐成为研究热点,可以加强这方面的研究,开发出更多高效低毒的新型多糖药物。