不同贮藏年份蜜兰香型岭头单丛茶 抗氧化成分及抗氧化活性的影响

陈荷霞,傅 力,李 云

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 8300522;2.韩山师范学院食品工程与生物科技学院,广东潮州 521041)

岭头单丛茶是广东省乌龙茶的主要名优茶,具有香气清高持久,滋味浓醇甘爽,蜜味甜润的特点。乌龙茶对人体有多方面的保健和药理作用,如降血脂[1],降胆固醇[2],防癌抗癌[3]和抗氧化[4]等功效。其中儿茶素、酚酸、黄酮以及其他黄酮衍生物是茶叶清除自由基、实现其抗氧化及保健作用的物质基础,茶叶中茶多酚含量与其自由基的清除能力呈现良好的量效关系[5]。研究报道氨基酸和咖啡碱具有较高的抗氧化活性,是潜在的抗氧化物质资源[6],茶色素也具有清除自由基的能力[7]。目前对单丛茶活性成分和抗氧化作用的研究主要集中在凤凰单丛茶,苏新国[8]等人研究表明凤凰单丛茶水浸出物中的茶多酚、茶黄素和茶红素等含量较高,同时表现出较高的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基,超氧阴离子和羟基自由基清除能力。Suetal[9]认为,凤凰单丛茶水提取液清除 DPPH自由基 的性能与多酚类含量密切相关。郑善元[10]等人分析认为单丛茶水提物抗氧化活性强,清除ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)自由基的效果明显高于清除DPPH自由基的效果。国内对岭头单丛茶的研究主要集中在加工技术[11]、种质鉴定[12]、品质化学特性[13-15]、加工过程中香气成分变化[16]和做青工艺[17]的研究。关于贮藏年份对岭头单丛茶抗氧化活性成分含量及其抗氧化活性影响的研究鲜见报道。本文对贮藏5年、10年、15年、20年和2016年(对照)制作的蜜兰香型岭头单丛茶中的茶多酚、黄酮、游离氨基酸、茶黄素、儿茶素和咖啡碱的含量进行测定,并测定不同贮藏年份单丛茶水提物对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力、对超氧阴离子的抑制能力及还原能力,为陈香岭头单丛茶新产品的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

茶青 均采于海拔1000 m左右的茶树,茶树种植管理方式相同,茶样均按照张博[11]的加工工艺制作,用铝箔封口袋密封,于室温保藏;贮藏5、10、15、20年的蜜兰香型岭头单丛茶、2016年制作的蜜兰香型岭头单丛茶(对照)样品 均由广东省饶平金利香生态农业有限公司提供;没食子酸(>99.0%)、乙二胺四乙酸(≥99%)、儿茶素(C≥99%)标准品、表儿茶素(EC≥99%)标准品、表儿茶素没食子酸酯(ECG≥99%)标准品、表没食子儿茶素(EGC≥99%)标准品、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG≥95%)标准品、咖啡碱(≥99%)标准品 上海融禾医药科技发展有限公司;抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基试剂盒 南京建成生物工程研究所;甲醇和乙腈(色谱纯)、乙酸乙酯、正丁醇、抗坏血酸(>99.7%)、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸、铁氰化钾、盐酸、碳酸氢钠、浓硫酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 上海阿拉丁生物科技股份有限公司。

TU-1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;4-16K型台式离心机 博动行仪器有限公司;ML204/02型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;ALPHA 1-4冷冻干燥机 成都华衡仪器有限公司;PHSJ-3F型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;Aglient 1200高效液相色谱仪 德国安捷伦公司;HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 将茶叶样品粉碎,过40目筛,放置于密封袋中备用。

1.2.2 主要抗氧化成分的测定方法 茶多酚:GB/T 8313-2008[18],以没食子酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程y=0.0132x+0.006,R2=0.9992。黄酮:三氯化铝比色法[19],以芦丁的质量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程y=11.161x-0.0079,R2=0.9995;游离氨基酸:GB/T8314-2013[20],以谷氨酸的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程y=2.982x-0.2577,R2=0.9991,茶黄素:系统分析法[21];咖啡碱:GB/T8312-2013[22];儿茶素:参考郭颖[23]测定的方法。

1.2.3 抗氧化能力的测定

1.2.3.1 单丛茶水浸提物的制备 称取5.00 g磨碎茶样按照1∶10 (g/mL)加入沸蒸馏水,沸水浴浸提20 min。立即趁热减压过滤。同样方法浸提四次,合并滤液,在-80 ℃ ℃经35 h冷冻干燥后得到茶水浸提物干粉[24]。

1.2.3.2 单丛茶水浸提物对DPPH自由基的清除实验 参考曹燕妮[24]的方法,分别配制0.1 mL不同贮藏年份不同浓度的茶水浸提物稀释液(茶水浸提物干粉与蒸馏水之比0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20 mg/mL),同时配制浓度分别为 0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 mg//mL的VC溶液0.1 mL,在上述溶液中加入3.9 mL 0.2 mmol/L 95%乙醇配制的DPPH自由基溶液,室温避光反应30 min,以95%乙醇作为空白,在517 nm处测吸光度。计算清除率为50%时的单丛茶水浸提物稀释液浓度和VC溶液浓度,记为IC50。以半数抑制浓度IC50的大小来比较抗氧化能力强弱。

式中,A0为空白样吸光度,A1为样品吸光度。

1.2.3.3 单丛茶水浸提物对羟基自由基的清除实验 参考曹燕妮[24]的方法,取1 mL蒸馏水,依次加入0.75 mmo1/L邻二氮菲1 mL,50 mmo1/L pH7.4的PBS缓冲液2 mL,充分混匀后加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4,混匀,最后加1 mL 0.01% H2O2,37 ℃保温60 min,在536 nm处测吸光度为AP,95%乙醇代替0.01% H2O2进行上述反应测吸光度为AB,1 mL不同浓度的茶水浸提物稀释液(茶水浸提物干粉与蒸馏水之比0.05,0.08,0.11,0.14,0.17,0.20 mg/mL)代替蒸馏水进行上述反应测吸光度为AS。计算清除率为50%时的单丛茶水浸提物稀释液浓度和VC溶液浓度,记为IC50。以半数抑制浓度IC50的大小来比较抗氧化能力强弱。

1.2.3.4 单丛茶水浸提物还原力实验 参考曹燕妮[24]的方法,分别在0.5 mL不同贮藏年份不同浓度茶水浸提物稀释液(茶水浸提物干粉与蒸馏水之比0.05,0.10,0.15,0.20,0.25 mg/mL)和不同浓度的的VC溶液(0.05,0.10,0.15,0.20,0.25 mg/mL)中加入2.5 mL pH6.6的磷酸盐缓冲液,再加2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液,振荡混匀,50 ℃恒温20 min后,再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液,然后以3000 r/min离心分离10 min,取上层清液2.5 mL,加蒸馏水2.5 mL和0.10% FeC13溶液0.50 mL,在700 nm处测定吸光度。计算还原力为0.5时的单丛茶水浸提物稀释液浓度和VC溶液浓度,记为EC50。以半数抑制浓度EC50的大小来比较抗氧化能力强弱。

1.2.3.5 单丛茶水浸提物抑制超氧阴离子自由基实验 按照南京建成生物工程研究所试剂盒提供的方法。测定不同贮藏年份不同浓度单丛茶水浸提物稀释液(茶水浸提物干粉与蒸馏水之比2.00,3.00,4.00,5.00,6.00 mg/mL)抑制超氧阴离子自由基作用,以抑制超氧阴离子自由基活力单位表示抗氧化能力。

1.2.3.6 综合指数法评价抗氧化能力 引用APC综合指数(Antioxidant potency composite index),采用以上四种抗氧化实验结果分析不同贮藏年份岭头单丛茶综合抗氧化能力[25]。

APC指数均值=方法1APC指数+方法2APC指数+…方法nAPC指数/n

1.3 统计分析

应用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 贮藏时间对单丛茶几种抗氧化成分含量的影响

2.1.1 茶多酚含量的变化 由图1可知,单丛茶茶多酚含量随着贮藏时间的延长而上升。贮藏20年时茶多酚含量达到最大值,由13.77 g/100 g上升到19.81 g/100 g,提高了6.04 g/100 g。各贮藏年份单丛茶的茶多酚含量均显著高于对照(p<0.05)。贮藏5年与10年的茶多酚含量差异不显著(p>0.05),其余各贮藏年份之间茶多酚含量差异均显著(p<0.05)。鲍晓华[26]在普洱茶研究中发现茶多酚在7年贮藏中呈上升趋势,多酚类物质大致可以分为水溶性的氧化产物(主要是茶黄素(TF)、茶红素(TR)和茶褐素(TB))、未被氧化的多酚类物质(主要是残留儿茶素)和非水溶性的转化物,随着贮藏时间的延长,可能是TR和TB形成较多,所以茶多酚的含量呈现上升。

图1 不同贮藏年份单丛茶茶多酚含量的变化Fig.1 Change of the tea polyphenol in single clump tea in different storage years注:不同小写字母表示不同贮藏年份 之间差异显著,图2～图6同。

2.1.2 黄酮含量的变化 由图2可知,单丛茶黄酮含量随着贮藏时间的延长而上升。贮藏20年时黄酮含量达到最高,由2.19 g/100 g上升到3.05 g/1 00 g,提高了0.86 g/100 g。贮藏10、15和20年的黄酮含量显著高于对照和贮藏5年的(p<0.05),对照与贮藏5年的黄酮含量差异不显著(p>0.05),其余各贮藏年份之间黄酮含量差异均显著(p<0.05)。黄酮类化合物在植物体内大部分与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在,也有以游离形式存在的,贮藏过程中黄酮含量的上升可能是结合形式存在的化合物转化成游离形式而溶出[26]。

图2 不同贮藏年份单丛茶黄酮含量的变化Fig.2 Change of the flavonoid content in single clump tea in different storage years

2.1.3 游离氨基酸含量的变化 由图3可知,单丛茶游离氨基酸含量随着贮藏时间的延长先下降后上升,总体呈下降趋势。贮藏5年时达到最低。贮藏20年,由1.85 g/100 g降低到1.03 g/100 g,降低了0.82 g/100 g。各贮藏年份的游离氨基酸含量显著低于对照(p<0.05),且各贮藏年份之间游离氨基酸含量差异均显著(p<0.05)。游离氨基酸变化趋势可能是由于贮藏前期游离氨基酸降解,随着贮藏时间延长,单丛茶含水量增加,水溶性蛋白质水解速率高于降解速率,致使游离氨基酸含量呈上升趋势[27]。

图3 不同贮藏年份单丛茶游离氨基酸含量的变化Fig.3 Change of the free amino acids content in single clump tea in different storage years

2.1.4 茶黄素含量的变化 由图4可知,单丛茶茶黄素含量随着贮藏时间的延长先上升后下降。贮藏5、10和15年的茶黄素含量显著高于对照和贮藏20年的单丛茶(p<0.05)。对照与贮藏20年、贮藏5年与10年的茶黄素含量差异均不显著(p>0.05),其余各贮藏年份之间茶黄素含量差异均显著(p<0.05)。茶黄素含量变化趋势与段慧[28]在福建乌龙茶陈化机理初探一文中茶黄素变化趋势一致,可能是由于贮藏过程中茶黄素和茶红素是一个双向转化过程,一方面儿茶素氧化聚合形成茶黄素,另一方面茶黄素和儿茶素进一步氧化形成茶褐素。贮藏前期茶黄素上升,但是随着贮藏年份的增加茶色素底物的来源儿茶素很少,贮藏中发酵程度的加深,茶黄素含量降低。

图4 不同贮藏年份单丛茶茶黄素含量的变化Fig.4 Change of the theaflavins content in single clump tea in different storage years

2.1.5 咖啡碱含量的变化 由图5可知,单丛茶咖啡碱含量随着贮藏时间的延长先下降后上升再下降。贮藏5年出现最低值。贮藏20年,由4.75 g/100 g下降到3.36 g/100 g,降低了1.39 g/100 g。各贮藏年份的咖啡碱含量显著低于对照(p<0.05)。贮藏5年与20年,贮藏10年和15年的咖啡碱含量差异均不显著(p>0.05),其余各贮藏年份之间咖啡碱含量差异均显著(p<0.05)。咖啡碱含量的变化趋势这与段慧[28]在福建乌龙茶陈化机理初探研究中一致,在常温下贮藏,咖啡碱含量减少原因可能是甲基转移的结果[29]。咖啡碱上升的原因有待于进一步研究。

图5 不同贮藏年份单丛茶咖啡碱含量的变化Fig.5 Change of the caffeine content in single clump tea in different storage years

2.1.6 儿茶素含量的变化 由图6和表1可知,单丛茶5种主要儿茶素总量随着贮藏时间的延长总体上升,贮藏20年时儿茶素总量达到最大值,由0.47 g/100 g上升到2.47 g/100 g,提高了2.00 g/100 g。各贮藏年份儿茶素总量显著高于对照(p<0.05),且贮藏20年的儿茶素总量显著高于其余各贮藏年份(p<0.05)。儿茶素组成中主要以ECG含量最高,其次是EGCG,在整个贮藏过程中EGCG和ECG的变化趋势与儿茶素总量变化趋势基本一致,贮藏20年,EGCG和ECG含量急剧上升导致儿茶素总量达到最大值,可能由于酯型儿茶素合成的前体为非酯型儿茶素和没食子酸衍生物转化所致,儿茶素类化合物的积累可能受到合成、水解或氧化、糖苷化、甲基化和聚合作用的共同影响[30]。

表1 不同贮藏年份单丛茶5种主要儿茶素含量g·(100 g)-1Table 1 Change of the 5 kinds main catechins content in single clump tea in different storage years(g/100 g)

图6 不同贮藏年份单丛茶5种主要儿茶素总量的变化Fig.6 Change of the 5 kinds main catechins total content in single clump tea in different storage years

2.2 抗氧化活性实验

2.2.1 水浸提物对DPPH自由基清除实验结果 由表3可知,不同贮藏年份单丛茶水浸提物对DPPH自由基都表现出显著的清除效果,且量效呈良好的线性关系(R2≥0.99),清除DPPH自由基能力均显著低于阳性对照VC(p<0.05)。清除DPPH自由基的能力依次为VC>20年>15年>10年>5年>对照。贮藏10年与15年单丛茶清除DPPH自由基的能力差异不显著(p>0.05),其余各贮藏年份单丛茶清除DPPH自由基的能力差异均显著(p<0.05)。

表3 不同贮藏年份蜜兰香单丛茶水 浸提物对DPPH自由基的清除效果Table 3 DPPH radicals scavenging ability of single clump tea water extracts in different storage years

2.2.2 水浸提物对羟基自由基清除实验结果 由表4可知,不同贮藏年份单丛茶水浸提物对羟基自由基都表现出显著的清除效果,且量效呈良好的线性关系(R2≥0.99)。清除羟基自由基的能力依次为20年>15年>10年>5年>对照>VC,各贮藏年份单丛茶水浸提物清除羟基自由基的能力显著高于VC(p<0.05)。对照和贮藏5年单丛茶水浸提物清除羟基自由基的能力差异不显著(p>0.05),其余各贮藏年份单丛茶水浸提物清除羟基自由基的能力差异均显著(p<0.05)。

表4 不同贮藏年份单丛茶对羟基自由基的清除效果Table 4 Hydroxyl radicals scavenging ability of single clump tea water extracts in different storage years

2.2.3 水浸提物还原力测定的实验结果 由表5可知,不同贮藏年份单丛茶水浸提物都表现出显著的还原效果,且量效呈良好的线性关系(R2≥0.99),还原力均显著低于阳性对照VC(p<0.05)。单丛茶水浸提物还原力依次为VC>10年>5年>20年>15年>对照,贮藏5年和10年、贮藏15年与对照、20年的单丛茶水浸提物还原力差异不显著(p>0.05),其余各不同贮藏年份之间单丛茶水浸提物还原力均差异显著(p<0.05)。

表5 不同贮藏年份单丛茶水浸提物还原力Table 5 Reduction power of single clump tea water extracts in different storage years

2.2.4 水浸提物抑制超氧阴离子自由基实验结果 由图7可知,不同贮藏年份单丛茶水浸提物抑制超氧阴离子自由基单位范围89.6～94.6 U/g,单丛茶水浸提物的抗氧化活性依次为10年>20年>5年>15年>对照,贮藏15年与对照、贮藏5年的单从茶茶水浸提物抑制超氧阴离子自由基能力差异均不显著(p>0.05)。其余各不同贮藏年份之间单丛茶水浸提物抑制超氧阴离子自由基能力差异均显著(p<0.05)。

图7 不同贮藏年份单丛茶水浸提物 抑制超氧阴离子自由基效果Fig.7 Superoxide radicals inhibiting ability of single clump tea water extracts in different storage years

2.3 综合指数法评价抗氧化能力

不同贮藏年份的单丛茶水浸出物清除DPPH自由基和羟基自由基的能力、还原力、抑制超氧阴离子自由基能力有一定的差异,可能是由于不同自由基的检测原理不同导致结果有一定的差异[31],故引用 APC 平均指数判断不同贮藏年份单丛茶综合抗氧化活性。综合抗氧化能力的大小依次为:贮藏20年(84.78%)>10年(89.40%)>15年(90.15%)>5年(91.23%)>对照(98.67%)。

2.4 主要抗氧化成分与抗氧化活性相关性分析

由表5可知,单丛茶水浸提物清除DPPH自由基能力与茶多酚含量相关系数达到0.984,达到极显著水平(p<0.01),与黄酮含量和儿茶素含量相关性系数分别为0.915和0.910,均达到显著水平(p<0.05),单丛茶水浸提物清除羟基自由基能力与黄酮相关系数为0.998,达到极显著水平(p<0.01),与茶多酚含量,儿茶素含量相关性系数分别为0.887,0.897,均达到显著水平(p<0.05)。茶水浸提物清除DPPH自由基和羟基自由基能力与游离氨基酸、茶黄素和咖啡碱呈负相关,且不显著(p>0.05)。茶水浸提物的还原能力与抑制超氧阴离子自由基能力与各测定成分含量相关性不显著。由表5得出,单丛茶在贮藏过程中主要抗氧化生化成分和抗氧化活性都会发生显著变化,两者之间具有不同程度的相关性,且茶多酚、黄酮和儿茶素含量与清除DPPH自由基、羟基自由基的能力均达到显著性正相关(p<0.05)。陈金娥[32]研究发现茶叶中的多酚类等物质和类黄酮化合物具有优异的抗氧化性能,它可以有效清除自由基,这与本研究的结果一致。

表5 不同贮藏年份单丛茶主要抗氧化成分 与水浸提物抗氧化活性相关性分析Table 5 The correlation analysis between the main antioxidant components and antioxidant activities of the water extract of single clump tea in different storage years

3 结论

20年贮藏期内,随着贮藏年份的增加,蜜兰香型岭头单丛茶的茶多酚、黄酮和儿茶素含量增加,游离氨基酸先下降后上升,咖啡碱含量先下降后上升再下降,茶黄素含量基本稳定不变。不同贮藏年份的岭头单丛茶清除DPPH自由基和羟基自由基的能力,抑制超氧阴离子自由基的能力及还原力均有差异,通过综合指数法(APC)评价不同贮藏年份单丛茶抗氧化活性大小依次为:贮藏20年>10年>15年>5年>对照。蜜兰香型岭头单丛茶水提物对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力与茶多酚、黄酮、儿茶素的含量呈显著性正相关(p<0.05),还原能力和抑制超氧阴离子自由基能力与抗氧成分之间相关性不显著。