超声辅助离子液体/阴离子表面活性剂双水相萃取虎杖中的虎杖苷和白藜芦醇

冯吉，李吉龙，马睿，马金鹏，王家琳，孙坤，王志兵

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012）

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎[1,2]，是我国著名的传统中药，具有利胆、止痛、散瘀、解毒、化痰和消炎等多种功效[2,3]。虎杖中含有蒽醌、多酚、蒽酮、多糖、鞣质、酚酸和游离氨基酸等多种活性成分[4～6]。据《中国药典》（2015版）报道，虎杖苷是虎杖中的主要标志性成分，有抗肿瘤，抗氧化、抗自由基，保护肝脏和治疗心血管病等作用[3]。因此，建立一种简单、高效、绿色的分析方法检测虎杖中的有效成分，对于中药虎杖及其医药产品的质量控制具有重要意义。

目前，常用于检测虎杖中虎杖苷和白藜芦醇的方法主要有紫外分光光度法[7]、毛细管电泳法[8]、定量核磁共振波谱法[9]和高效液相色谱法[10,11]等，由于高效液相色谱法具有分离效率高、选择性好、检测灵敏度高、操作自动化等优点，常用于中药有效成分的分离和检测。常用于中药活性成分的提取方法主要有热回流提取法[12,13]、微波提取法[14～16]、超声波提取法[17～19]、超临界流体萃取法[20]和碱提酸沉法[21]等。但上述方法不仅需要易挥发的有机溶剂，而且处理过程费时费力。

离子液体是在室温下一种呈液态的熔融盐，它由有机阳离子和无机或有机阴离子组成。离子液体无味、不燃、挥发性低，化学稳定性和热稳定性良好[22]，且对有机或无机化合物具有良好的溶解性[23]，所以离子液体常代替传统有机溶剂用于提取分离等领域[24]。由于离子液体与阴离子表面活性剂之间存在静电相互作用，在一定浓度条件下导致两者的混合溶液自发的形成互不相容的两相，即双水相体系[25]。因此，本研究首次采用超声辅助的离子液体/阴离子表面活性剂双水相体系提取虎杖样品中的虎杖苷和白藜芦醇，并通过高效液相色谱对目标分析物进行定量分析与检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

六种虎杖样品分别购于当地不同药房（吉林长春）。样品粉碎后过120目筛，于60 ℃下烘干至恒重，备用。标准品虎杖苷和白藜芦醇，购于美国Sigma公司，并使用甲醇配制成浓度为500 μg/mL的标准储备液。色谱级甲醇，购于美国Fisher公司；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C4MIM][BF4]）、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C6MIM][BF4]）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C8MIM][BF4]）购于上海成捷化学有限公司；十二烷基苯磺酸钠（SDBS），购于国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯，购于北京化工厂。

1.2 仪器与设备

1100型高效液相色谱仪配有二极管阵列检测器，美国Aglient公司；Zorbax SB-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm I.D.），美国Aglient公司；C18预保护柱（5 μm，7.5 mm×2.1 mm I.D.），美国 Aglient公司；KQ5200DE数控超声波清洗器，江苏昆山超声仪器有限公司；Allegra 5430R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 超声辅助离子液体/阴离子表面活性剂双水相萃取

准确称取0.01 g虎杖样品于10 mL离心管中，同时加入4 mL超纯水（pH 7.0）和400 μL离子液体，手动振摇30 s，混合均匀后，加入SDBS 0.16 g，涡旋混合2 min，并于30 ℃下超声提取20 min（160 W，40 Hz），然后以3000 r/min的转速离心20 min，此时形成双水相，准确读取上相（离子液体相）体积，并吸取10 μL过0.22 μm滤膜，进行色谱分析。具体的操作流程如图1所示。

图1 超声辅助离子液体/阴离子表面活性剂双水相萃取流程图Fig.1 Procedure of ultrasound-assisted ionic liquid / anionic surfactant aqueous two-phase extraction

1.4 色谱条件

流动相由甲醇（A）-水（B）组成，梯度洗脱：0～6 min，38%A；6～12 min，38～70%A；12～22 min，70%A；22～25 min，70～38%A；25～35 min，38%A。流动相流速0.5 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃，检测波长306 nm。

1.5 数据统计分析

提取率计算公式见公式（1），回收率计算见公式（2）。本方法精密度以相对标准偏差（RSD）表示。所有实验数据用Origin 8.0软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

2.1.1 离子液体的选择

图2 离子液体的体积对提取率的影响Fig.2 Effects of ionic liquid volume on the extraction yield

离子液体的结构和组成是影响溶液双水相行为的关键因素。当SDBS用量为0.16 g时，考察了三种离子液体[C4MIM][BF4]、[C6MIM][BF4]、[C8MIM][BF4]对相分离的影响。实验结果表明，当选用[C6MIM][BF4]和[C8MIM][BF4]作为离子液体时，随着离子液体浓度的增加，样品溶液始终保持澄清状态。

当选用[C4MIM][BF4]作为萃取剂时，随离子液体浓度的增加，溶液中出现四种相行为：（1）当离子液体用量低于320 μL时，溶液保持澄清状态，为均相溶液；（2）随离子液体体积增加，溶液的黏度不断增加，当离子液体用量为360 μL时，开始出现分相界面，即双水相；（3）当离子液体用量为400 μL时，上相体积达到0.5 mL，此时目标分析物的提取率达到最大值；这可能与离子液体和目标分析物之间存在较强的 π-π堆积、静电和疏水相互作用有关；（4）当离子液体体积继续增加时，双水相体系的上相体积不断增加，提取率则无明显变化。从节约溶剂和富集倍数的角度考虑，本研究选择400 μL[C4MIM][BF4]为萃取溶剂。离子液体体积对目标分析物提取率的影响见图2。

2.1.2 SDBS用量

当[C4MIM]BF4的体积为400 μL时，考察SDBS质量（0.08～0.20 g）对目标分析物提取率的影响（见图3）。当SDBS用量从0.02 g增加到0.06 g时，溶液的黏度逐渐增加；当SDBS用量达到0.08 g时，双水相体系形成；当SDBS用量从0.08 g增加至0.16 g时，目标分析物提取率达到最大值；当SDBS用量高于0.2 g时，相分离界面消失，形成均相溶液。因此，本研究选择SDBS用量为0.16 g。

图3 SDBS的用量对提取率的影响Fig.3 Effect of amount of SDBS on extraction yields

2.1.3 样品溶液的pH值

图4 样品溶液的pH值对提取率的影响Fig.4 Effects of pH value on the extraction yield

溶液的pH值会影响目标分析物的电离状态和溶解度。所以，本研究考察了溶液pH（1～11）值对虎杖苷和白藜芦醇提取率的影响。实验结果如图4所示，当溶液pH＜10时，目标分析物的提取率基本不变，而溶液颜色随pH值的增加而加深，当pH＞11时，双水相上相体积大幅增加，富集倍数减小，并有白色沉淀产生。为了便于操作，本研究选择样品溶液pH 7.0。

2.1.4 超声时间

图5 超声时间对提取率的影响Fig.5 Effects of ultrasound time on the extraction yield

超声波不仅能击碎植物细胞壁，增加提取溶剂的穿透能力，提高萃取效率，而且能增大分子运动频率和速度，利于双水相体系的形成。因此，本研究考察了当超声功率为160 W时，超声时间（0、5、10、15、20、30、40 min）对目标化合物提取率的影响。

实验结果表明，当不使用超声时，体系的分相时间大大增加，目标分析物的提取率最低。随超声时间的增加，下相越来越澄清，体系的分相时间则大大减少，从图5中可以看出，当超声时间达到20 min时，双水相体系分相界面清晰，目标物提取率最高。所以，本研究选择超声时间为20 min。

2.1.5 超声功率

图6 超声功率对提取率的影响Fig.6 Effects of ultrasound powder on the extraction yield

从图6可以看出，目标分析物的提取率随超声功率的增加不断升高，当超声时间为20 min，超声功率为160 W时，目标分析物提取效果最好。因此，本研究选择超声功率为160 W。

2.2 方法评价

2.2.1 分析性能

配制含有虎杖苷和白藜芦醇的一系列浓度的标准溶液，在最佳色谱条件下分析样品，以分析物浓度（C）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。实验结果表明，各目标化合物在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数r＞0.9995；检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为2.8～12.3和9.4～41.1 ng/mL。通过1 d内连续的分析5次虎杖样品所得到提取率的相对标准偏差（RSD）为日内精密度。通过连续分析5 d、每天分析一次虎杖样品所得到提取率的相对标准偏差（RSD）为日间精密度。实验结果表明，各目标化合物的日内和日间精密度分别为 2.81～3.27和4.67～6.31%之间。因此，本研究方法的重现性是令人满意的。

2.2.2 回收率

为了研究本方法的准确度，本实验分析了加标样品的回收率。结果表明，目标化合物回收率为86.88～94.13%，其相对标准偏差均低于 6.77%，这表明本法具有满意的回收率和精密度，可用于中药活性成分的提取与检测。为了评价本方法的适用性，本研究对不同产地的虎杖样品进行了分析。

表1 分析性能Table 1 Analytical performance

表2 化合物的回收率Table 2 Recovery of chemical compounds

表3 不同产地样品中虎杖苷和白藜芦醇的含量Table 3 The content of polydatin and resveratrol in samples from different habitats

图7 标准溶液(A)和样品提取液(B)色谱图Fig.7 Chromatograms of the standard solution (A) and the sample extract (B)

实验结果如表3所示，样品中的虎杖苷和白藜芦醇的含量分别为16.92～37.78和1.56～6.06 mg/g。另外，不同产地虎杖中两种成分的含量也有差异，这可能是由于光照、气候以及土壤等条件的差异对虎杖中这两种成分有影响。样品色谱图如图7所示。

3 结论

本研究将超声辅助萃取与离子液体双水相萃取相结合，建立一种简便、高效、绿色的超声辅助离子液体/阴离子表面活性剂双水相萃取法，用于提取虎杖中的主要药效成分，同时采用高效液相色谱法对其进行定量检测。本研究以离子液体代替传统有机溶剂为萃取剂，避免了有机溶剂的挥发对环境及实验人员的危害。其他方法相比，本法具有样品用量少、操作简单、绿色环保、提取时间短等优点，可广泛用于中药中多酚类化合物的提取分析。