564例肺结核患者痰标本质量对检测结果的影响

杨新宇　李波　赵琰枫　王嫩寒　张洁　易俊莉　田丽丽　任怡宣 樊瑞芳　赵文娟　陈昊　陈双双　代小伟　丁北川

实验室诊断是结核病诊断、治疗及预防控制过程中所必需的。结核病实验室检查尤其是细菌学检查是发现传染源的最主要手段，是确诊结核病和选择治疗方案的主要依据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。细菌学检验结果的准确性首先取决于标本的质量[1]。正确地采集、留取标本是直接影响检验结果的重要因素和取得准确结果的前提[2]。世界卫生组织在《2017年全球结核病报告》[3]中指出，2016年在世界范围内约有1040万例结核病新发患者，发现并得到正式报告的仅为630万例，留下的缺口有410万例。结核病患者漏诊和漏报问题仍然是一个挑战，痰液检查是诊断肺结核的重要手段，如未能及时留取合格的痰标本，将会延误患者的诊断和治疗[4]。笔者收集了2016年至2017年在北京结核病控制研究所初诊并最终被确诊为肺结核的564例患者的1692份痰标本，分析痰标本质量对分枝杆菌涂片、培养结果的影响，为临床诊断、治疗工作提供参考。

资料和方法

一、研究对象及诊断标准

1．研究对象：收集2016年1月至2017年12月初次就诊于北京结核病控制研究所门诊部，并最终被诊断为肺结核的564例患者。每例患者初诊时留取3份痰标本进行细菌学检查，包括3份抗酸染色涂片检查，并选择其中2份性状较好的痰标本同时做分枝杆菌培养；培养项目根据患者的病情、需求及经济能力进行选择[固体培养或液体培养(BACTEC MGIT 960)]。

2．资料来源：以实验室检查为主，结合胸部影像学检查和患者的临床表现，以及必要的辅助检查和鉴别诊断，综合分析后确诊为肺结核患者的痰标本。

3．诊断标准：按照《WS 288—2008 肺结核诊断标准》,肺结核分确诊患者、临床诊断患者和疑似患者。本研究仅讨论确诊患者和临床诊断患者。

确诊患者诊断标准：(1)痰涂片阳性肺结核。①2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；②1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+胸部影像学检查有与活动性肺结核相符的病变；③1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份痰分枝杆菌培养阳性。(2)仅分枝杆菌分离培养阳性+胸部影像学检查有与活动性肺结核相符的病变。(3)肺组织病理学检查符合结核病病理改变。

临床诊断患者：3次痰涂片均为阴性，胸部影像学检查有与活动性肺结核相符的病变，并伴以下任一条：(1)临床有肺结核可疑症状；(2)结核菌素试验强阳性；(3)结核抗体检查阳性；(4)肺外组织活检病理诊断为结核病变；(5)疑似肺结核患者经诊断性治疗或随访观察可排除其他肺部疾病者[5]。

二、试剂及方法

1．试剂：萋-尼抗酸染色液，酸性罗氏培养基由珠海贝索生物技术有限公司提供，BACTEC MGIT 960 分枝杆菌培养管由美国BD公司提供。

2．痰涂片检测方法及分级报告标准：痰涂片镜检采用萋-尼染色，按照《结核病实验室检验规程》[6](简称《规程》)进行抗酸杆菌痰涂片镜检。镜检结果分级报告结果：(1)萋-尼染色抗酸杆菌阴性，即连续观察 300个不同视野，未发现抗酸杆菌；(2)萋-尼染色抗酸杆菌阳性，即抗酸杆菌菌数为1～8条/300个视野；(3)萋-尼染色抗酸杆菌阳性“+”，即3～9条/100个视野，连续观察300个视野；(4)萋-尼染色抗酸杆菌阳性“++”，即1～9条/10个视野，连续观察100个视野；(5)萋-尼染色抗酸杆菌阳性“+++”，即1～9条/视野；(6)萋-尼染色抗酸杆菌阳性“++++”，即≥10条/视野[6]。统计学计算时根据菌量，分为“1～8条/300个视野、+和++、+++和++++”3个数量等级进行比较。

3．痰培养检测方法及分级结果判读：分枝杆菌固体培养采用简单法，液体培养采用中和离心法。按照《规程》进行分枝杆菌分离培养检查。分级结果判读：(1)无菌落生长报告为培养阴性；(2)菌落生长不及斜面1/4时，则报告实际菌落数；(3)菌落占斜面面积1/4时报告“+”；(4)菌落占斜面面积1/2时报告“++”；(5)菌落占斜面面积3/4时报告“+++”；(6)菌落布满培养基斜面报告“++++”。固体培养、液体培养的阳性培养物均需经涂片显微镜检查确定为抗酸杆菌后方可报告[6]。统计学计算时根据菌量，将报告分为“实际菌落数、+和++、+++和++++”3个数量等级进行比较。

4．痰性状分类标准：(1)干酪痰。标本外观以黄色或奶酪色、脓样、团块状的肺泡分泌物为主，稠度较黏液痰低，制片时较易涂抹。(2)血痰。此类标本是在黏液痰或干酪痰标本中混有血液，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝。(3)黏液痰。标本外观以白色、黏稠度较高的肺部和支气管分泌物为主。干酪痰、血痰及黏液痰为合格标本。(4)唾液。目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、黏稠度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；由于唾液标本进行抗酸杆菌检查时的检出率很低，在患者确定诊断时为不合格标本[6]。

5．质量控制：按照《规程》要求，进行抗酸杆菌痰涂片镜检及分枝杆菌培养的室内质量控制及室间质量评价[6]。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0 软件进行统计学处理，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

一、初诊肺结核患者3份痰标本性状分析

564例初诊肺结核患者中，确诊患者242例，占42.9%(242/564)。3份痰标本均合格者311例，占55.1%(311/564)；3份标本均合格的患者中，确诊患者占51.4%(160/311)。3份标本均不合格者118例，占20.9%(118/564)；其中确诊患者占22.9%(27/118)(表1)。3份痰标本均合格者细菌学检查确诊为肺结核患者的比率是3份均不合格痰标本者的2.2倍(51.4/22.9)。

二、不同检测方法在合格痰标本和不合格痰标本中的阳性分布情况

564例初诊肺结核患者共收集1692份痰标本，其中痰涂片检查1692份，固体培养检查992份，液体培养检查136份。 1692份痰标本中，合格者1138份，合格率67.3%；初诊肺结核中合格痰标本涂片、固体培养、液体培养阳性率分别为21.1%、37.4%和68.0%(表2)。不合格痰标本涂片、固体培养、液体培养阳性率分别为3.4%、16.2%和27.8%；经统计学分析，涂片、固体培养、液体培养的阳性率在合格痰标本和不合格痰标本中差异均有统计学意义(χ2值分别为89.637、44.037、17.509，P值均<0.001)。不论是合格标本还是不合格标本，液体培养的阳性率均明显高于固体培养(表3)；在564例初诊肺结核患者中，有124例患者同时进行了固体培养和液体培养，固体培养的阳性率为40.3%(50/124),液体培养的阳性率为56.5%(70/124)。

三、初诊肺结核患者不同性状阳性痰标本在涂片、固体培养检查中量化分级结果比较

1692份痰标本中共检出阳性涂片259份，合格痰标本阳性涂片主要分布在“+和++”，不合格痰标本阳性涂片主要集中在“1～8条”及“+和++”。不同痰性状的标本，涂片阳性结果在不同量化分级标本间差异有统计学意义(χ2=7.99，P=0.016)(表4)。 992份痰标本中用固体培养法共检出阳性标本307份，合格痰标本固体培养阳性者在不同分级标本中呈较平均分布，不合格痰标本的阳性者主要集中在“+”以下；不同痰性状的标本，培养阳性结果在不同量化分级标本间差异有统计学意义(χ2=20.05，P<0.001)(表5)。

表1　不同诊断分类肺结核初诊患者在各类3份痰标本组合中的分布(例)

表2　1138份不同性状合格痰标本采用3种技术进行检测的结果分析

注部分标本总份数不到30份，计算阳性率差异无统计学意义，故阳性率不做统计

表3　不同检测技术对合格与不合格痰标本的检测阳性率比较

表4　不同涂片量化分级标本在合格与不合格痰标本中涂片阳性结果的比较

表5　不同培养量化分级标本在合格与不合格痰标本中固体培养阳性结果的比较

讨　　论

《WS 288—2017 肺结核诊断》[7]标准已于2018年5月1日实施，病原学诊断是肺结核诊断的金标准。检验结果正确与否关键在于质量保证体系，质量保证体系分为分析前、分析中和分析后的质量控制。导致临床实验室检验结果出现差错，多数在分析前或分析后阶段[8]。在实验误差中，分析前误差约占70%，因此分析前质量保证是临床实验室质量保证体系中最关键的环节之一，是确保检验信息正确有效的先决条件[9-10]。而微生物实验室分析前质量失控的主要原因是临床送检标本不合格[11]。

《“十三五”全国结核病防治规划》明确提出，到2020年肺结核患者病原学阳性率要达到50%以上[12]，2016—2017年我研究所细菌学检查阳性率为42.9%，距离“十三五”要求还有一定差距。任何病原学检查项目，合格痰标本的留取对于检查结果的影响都至关重要。通过比较发现，无论是涂片结果还是培养结果，合格痰标本(干酪痰、血痰、黏液痰)的阳性检出率及量化分级指标均远远高于不合格标本(唾液)，差异有统计学意义；在259份抗酸杆菌涂片阳性的痰标本中不合格标本(唾液)占19份，阳性检出率极低，仅为3.4%；不合格标本在分枝杆菌培养检查中不但阳性率低，而且在阳性量化分级中主要集中在菌量较小的“+”以下；3份痰标本均合格者细菌学检查确诊为肺结核患者的比率是3份均不合格痰标本者的2.2倍；痰涂片阳性率和痰培养阳性率随痰质量的提高而增加，差异有统计学意义；说明了痰标本质量在肺结核诊断中的重要性[13]。采用液体培养法进行处理的痰标本，无论是合格痰标本还是不合格痰标本，阳性率均明显高于固体培养，即使唾液标本检测阳性率还是比较低(27.8%)，但是也已远远超过其在固体培养中的阳性率(16.2%)；对于相同研究对象(同时进行固体培养和液体培养的124例患者)液体培养的阳性率提高了16.2%。张娟等[14]也报道，全自动MGIT 960液体培养方法的敏感度和特异度均高于罗氏固体培养法，分析认为固体培养对于痰标本的前处理采用的是4%氢氧化钠，而液体培养前处理采用的是2%氢氧化钠，在控制好污染率的同时缩短了分枝杆菌的阳性报告时间[15]；由于液体培养的前处理液采用的是较低浓度氢氧化钠处理痰标本，以及离心集菌的前处理方法，因而增加了对菌量较少标本的阳性检出率。故笔者推荐实验室分枝杆菌分离培养尽可能采用液体培养的方法，以提高阳性率。另外，对于痰液性状的判断，每个检验者主观认识有差异，单纯用干酪痰、血痰、黏液痰、唾液区分不能客观地反映痰标本是否合格，合格的痰标本为平均每低倍镜视野里鳞状上皮细胞应小于10个，白细胞数应大于25个，痰标本白细胞数是诊断肺结核痰标本可接受的一个指标[16]。因此，笔者认为用量化细胞数更能反映痰标本是否合格，建议将标本性状和细胞数一同报告在结果中，为临床提供可靠的参考依据。

北京市按照《北京市结核病防治规划(2011—2015年)》[17]的要求切实加强肺结核患者的发现力度，强调了综合医疗机构与结核病防治机构(简称“结防机构”)合作的重要性，开展结核病“医防合作”的防治模式[18]，通过加强对密切接触者筛查、新生入学体检等措施，重视和加强主动发现策略，稳步推进结核病“早发现、早诊断、早治疗”[19]。因此推测，由于许多肺结核患者是在发病早期或者没有临床症状的阶段被发现，导致患者的痰标本性状不容易达到合格的要求。本研究显示，在564例肺结核患者1692份痰标本中，3份标本均合格者占55.1%(311/564)，2份标本合格者占12.4%(70/564), 1份标本合格者占11.5%(65/564),3份标本均不合格者占20.9%(118/564)。在肺结核患者的3份痰标本中，有23.9%的患者留出过合格的痰标本，说明即使留取困难，这部分患者仍然有可能留出合格的痰标本。

《国际医学实验室认可准则》明确要求要监测检验全程(TTP)的质量。目前，分析阶段的误差得到了有效控制；而分析前、后阶段的误差成为影响质量的主要因素。因而,监测与改善分析阶段外的质量将是我们面临的任务[20]。通过加强医生-护士-患者的合作，用有效数据直接与患者进行沟通，强调痰标本质量对于检出率的重要性，强调合格痰标本是来自支气管或肺深部的脓样、干酪样或黏液样痰液，痰量不少于3 ml；用发放宣传卡片、观看视频等方式进行有效的宣传教育(简称“宣教”)。宣传资料的词句尽可能减少使用过于专业的词汇，做到简单易懂；对痰少不能咳出者，指导其有效咳嗽排痰的技巧，可采用背部叩击法诱导排痰[21]；对无咳嗽、无痰患者，医生可开医嘱给予2.5%氯化钠雾化吸入导痰[22]；必要时与患者家属沟通，帮助和指导患者采用正确的方式采集标本,切实提高患者留取合格痰标本的比例。

综上所述，本研究初诊肺结核患者痰标本的留取合格率较低，应加强对患者的宣教力度，充分说明痰标本质量对检查结果的重要性，并采取切实有效的指导和措施，保证分析前留取痰液的质量控制；鉴于液体培养的敏感度及特异度均较高，有能力的实验室应积极开展液体培养，以提高分枝杆菌检出阳性率，从而保证肺结核诊断的准确性。