内源性硫化氢抗氧化作用对乙酸溃疡性结肠炎模型小鼠黏膜损伤的影响

梁慧洁， 陈尼维， 赵祥运， 朱梅影， 伏桂香， 闫厚煜

(1. 上海交通大学附属第六人民医院消化内科，上海　310000; 2. 厦门市第一医院，福建 厦门　361011)

近年来，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)的发病率呈现出逐年上升的趋势。有关活性氧，包括超氧阴离子、过氧化氢、次氯酸、羟自由基和氮等，与炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的相关性多有报导。有研究[1]提示硫化氢(H2S)与胰腺炎、脓毒血症、关节炎、慢性阻塞性肺病等炎性疾病密切相关。宋敏敏等[2]发现，内源性H2S能够有效抑制实验性大鼠胰腺纤维化。H2S的抗炎机制可能与抗氧化、舒展血管、促中性粒细胞凋亡、降低NF-κB活性、减少白细胞-内皮细胞黏附有关。研究[3]发现，肠壁受损后胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)及3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)表达显著增高，且在溃疡部位更加明显。本研究以乙酸诱导小鼠UC，探讨H2S是否能通过其抗炎抗氧化作用对UC进行保护并探讨可能的机制。

1　材料与方法

1.1　实验动物及主要试剂

健康雄性昆明小鼠40只，7～8周龄，体质量20～30g，购自上海交通大学附属第六人民医院实验室。小鼠饲养环境为SPF级： 通风良好，20℃恒温，60%～70%湿度，12h： 12h光照周期。自然光照下分笼饲养，实验动物饲以标准普通饲料和水，自由取食和饮水。

乙酸、硫氢化钠(NaHS)、DL-炔丙基甘氨酸(PAG)、乙酸锌、对苯二胺盐酸盐、三氯化铁、三氯乙酸购自Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)生化试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ELISA试剂盒购自Cloud-Clone Corp公司；CSE抗体购自Santa Cruz公司。

1.2　小鼠UC模型的建立

昆明小鼠40只，随机分为4组： 对照组、模型组乙酸+NaHS(H2S供体)组、乙酸+PAG(CSE酶的抑制剂)组。采用乙酸UC造模方法对对照组以外的3组进行造模。昆明小鼠禁食12h后，配制8%乙酸，小鼠麻醉，用硅胶管钝头插入小鼠肛门约4cm，抽取8%乙酸0.15mL顺硅胶管注入小鼠肛门，速度不宜过快，完成后倒提鼠尾20s，注入1～2mL生理盐水冲洗，稀释肠内乙酸，常规饲养，对照组同样处理，不加乙酸。灌肠1d后,H2S组每天腹腔注射供体NaHS 50μmol/kg，PAG组每天腹腔注射CSE酶抑制剂PAG 10mg/kg，其余两组每天腹腔注射等体积生理盐水溶液。药物干预后3d处死小鼠。

1.3　结肠炎症程度及造模情况的评估

自实验开始即每天记录小鼠活动及进食情况以及有无腹泻、便血、体质量减轻,每日留取小鼠粪便进行隐血测定，测量小鼠造模前及造模后的体质量，按Okayasu等[4]标准进行DAI评分。处死小鼠后观察肠黏膜外观,参照Luk等[5]标准进行结肠组织大体评分，无损伤为0分；黏膜充血但没有溃疡为1分；充血而且肠病变厚但没有溃疡为2分；有一处溃疡但没有肠壁增厚为3分；有两处或两处以上溃疡/炎症为4分；有两处或两处以上大溃疡或有一处溃疡/炎症沿结肠纵轴超过1cm为5分；沿结肠纵轴损伤超过2cm，每超过1cm加1分，为6～10分。取近肛门端结肠组织及有溃疡部位结肠组织进行固定、H-E染色,参照Ekstrom等[6]标准进行结肠组织病理评分，见表1。

表1　结肠组织病理评分表

1.4　血清H2S的测定

小鼠处死前，麻醉后心脏穿刺采血0.5～1.0mL，注入肝素抗凝真空采血管中,静置2h后低温离心(离心半径16cm，3000r/min，离心10min)，分离血浆。在试管中加入0.5mL 10g/L浓度的醋酸锌，再加入0.2mL血浆标本，震荡均匀，再依次加入20mmol/L对氨基二甲基苯胺盐酸盐0.5mL、30mmol/L三氯化铁0.4mL、室温孵育20min，加入10%三氯乙酸1mL，加入蒸馏水补足体积至5mL。离心半径16cm，6000r/min，离心5min，吸出上清液，在波长670nm处用分光光度计检测吸光度(A670)。根据H2S标准曲线计算上清液中H2S的含量。

1.5　ELISA法测定HO-1、NQO-1

处死小鼠后，取病变组织制备匀浆，离心半径16cm，3000r/min，离心20min,收集上清液,参照ELISA试剂盒说明书进行操作，根据标准曲线计算HO-1、NQO-1含量。

1.6　生化法测定MDA、SOD、GSH

取病变组织制备匀浆，离心半径16cm，3000r/min，离心20min,收集上清液,参照MDA、SOD、GSH试剂盒说明书进行操作。用分光光度法测量出MDA、SOD、GSH含量。

1.7　Western印迹法

取病变组织制备匀浆，以裂解液裂解，使用胞浆蛋白提取试剂盒提取胞浆蛋白,BCA法测蛋白浓度。每孔上样100μg蛋白,12% SDS-PAGE凝胶电泳分离,将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭2h,孵育一抗(CSE抗体),4℃过夜,次日室温孵育HRP标记的二抗(1： 10000稀释)1h。化学发光法显示结果,压片曝光,显影定影,采用凝胶成像分析系统拍照,使用Image J软件进行灰度分析。

1.8　统计学处理

2　结　　果

2.1　小鼠的一般情况和DAI评分

对照组小鼠活动、进食情况如常，无腹泻、体质量减轻、便血等情况。模型组乙酸灌肠后出现腹泻、体质量减轻、便血等情况。灌肠后3d，上述症状达高峰。PAG组上述症状相较于模型组及NaHS组重，而NaHS组较模型组减轻。模型组、NaHS组、PAG组DAI评分均高于对照组(P<0.05)，PAG组高于模型组、NaHS组(P<0.05)，NaHS组较模型组较低(P<0.05)，见表2。

2.2　大体和病理损伤评分

肉眼观察，对照组小鼠结肠大体标本无水肿、糜烂和溃疡的形成，模型组、NaHS组及PAG组均可见黏膜充血水肿糜烂及溃疡形成，但NaHS组病变程度轻于模型组，PAG组较模型组、NaHS组重，见表2。组织病理切片显示，除对照组外，其他3组病变结肠黏膜均出现不同程度的水肿、出血、溃疡、隐窝消失、伪膜形成,各层均有淋巴细胞和嗜中性粒细胞浸润,病变呈连续性，病理损伤评分均高于对照组(P<0.05)，PAG组高于模型组及NaHS组(P<0.05)，NAHS组则低于模型组(P<0.05)，见表2、图1。

表2　疾病活动度及炎症程度评分Tab.2　Disease activity index and inflammation score

与对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与NaHS组相比，cP<0.05

图1　各组小鼠结肠组织H-E染色Fig.1　Colonic tissue H-E staining in mice of each group

2.3　血清H2S含量比较

模型组、NaHS组血浆H2S含量高于正常对照组(P<0.05),PAG组低于NaHS组和模型组，NAHS组高于模型组及对照组(P<0.05)，见表3。

2.4　结肠组织HO-1、NQO-1含量

模型组、PAG组、NAHS组结肠组织HO-1含量低于正常对照组(P<0.05)，NaHS组高于模型组(P<0.05)，PAG组低于模型组及NaHS组(P<0.05)。模型组、PAG组、NAHS组结肠组织NQO-1含量低于正常对照组(P<0.05),NaHS组高于模型组(P<0.05)，PAG组低于NAHS组(P<0.05),见表3。

2.5　结肠组织MDA、SOD、GSH含量

模型组结肠组织MDA含量高于对照组(P<0.05)，而NaHS组低于模型组(P<0.05)，PAG组高于对照组及NaHS组(P<0.05)。模型组、PAG组(P<0.05)、NAHS组结肠组织SOD活力、GSH含量相对表达量明显低于正常对照组(P<0.05),NAHS组高于模型组(P<0.05)，PAG组低于模型组及NAHS组(P<0.05)，见表4。

表3　各组血清H2S含量,结肠组织HO-1、NQO-1含量Tab.3　The levels of H2S in serum and the levels of HO-1、NQO-1 in colonic tissue of each groups

与对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与NaHS组相比，cP<0.05

表4　各组结肠组织MDA、GSH含量、SOD活力Tab.4　The levels of MDA、GSH and the activity of SODin colonic tissue of each groups

与对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与NaHS组相比，cP<0.05

2.6　Western印迹法结果

模型组CSE量较其他3组升高(P<0.05)，PAG组CSE量较NaHS及模型组降低(P<0.05)，NAHS组CSE量较模型组降低(P<0.05)，见图2。对照组、模型组、NAHS组和PAG组CSE/GAPDH量分别为0.60±0.04、0.86±0.18、0.44±0.25、0.28±0.10。

图2　各组结肠CSE蛋白表达水平Fig.2　The levels of CSE protein expression in the colon homogenates

3　讨　　论

近年来，研究[7]表明氧自由基和抗氧化酶失衡所导致的氧化应激与UC密切相关。研究[8]显示，自发性UC实验犬血清ROS较健康对照组升高。乙酸UC模型的致病机制、组织病理学特征及炎性介质与人类IBD相似，均存在显著的氧化物与抗氧化物失衡[9]。本研究发现，相较于对照组，模型组结肠MDA含量升高，且HO-1、NQO-1含量及MDA、SOD、GSH活性降低。以往研究[10]发现乙酸UC小鼠血清抗化酶活性(SOD、GSH)降低，氧化损伤标志物MDA含量升高，与本研究结果相似。综上所述，UC的黏膜损伤机制可能与过氧化物的增多及抗氧化酶活性的下降呈正相关。

H2S的抗炎的作用已被逐渐认识。本研究发现，与模型组相比，NaHS组DAI、大体及病理损伤评分均低于模型组，并且PAG组评分均高于模型组，这表明H2S对UC具有保护作用。研究[11]显示，H2S对UC具有治疗作用，并认为其机制可能与上调CSE的表达并提高随后的H2S释放有关，这与本研究一致。研究[12]用H2S干预UC小鼠，发现H2S可减轻肠黏膜损伤，并能降低结肠组织IL-4含量。研究[13]显示，上调乙酸UC小鼠结肠组织中的GSH、SOD等抗氧化酶的表达可降低肠黏膜损伤。本研究发现，NaHS组HO-1、NQO-1含量及MDA、SOD、GSH活性升高，并且氧化标志物MDA含量降低，抑制H2S的产生后则相反，由此推断H2S的保护作用与对抗氧化酶的激活密切相关。

本研究通过乙酸诱导小鼠UC模型发现，内源性H2S能有效减轻肠黏膜损伤，其中的机制可能与上调抗氧化酶的表达有关。小鼠乙酸UC模型虽能模拟人类UC，但具体机制并不完全一致，因此H2S能否作为一种抗氧化剂进入临床用于治疗UC还需进一步研究。