高效液相色谱法测定阿莫西林克拉维酸钾咀嚼片中的有关物质

2018-07-10聂忠莉王晓玲黄金玉萧茂玲

成都大学学报（自然科学版） 2018年2期

聂忠莉，杨　慧，王晓玲，黄金玉，张　勇，萧茂玲

(1.成都大学药学与生物工程学院，四川成都　610106；2.成都克莱蒙医药科技有限公司，四川成都　610041)

0　引　言

阿莫西林克拉维酸钾咀嚼片，是由阿莫西林三水合物和克拉维酸钾组成的复方制剂，阿莫西林为杀菌性广谱抗生素，克拉维酸钾为不可逆的广谱β-内酰胺酶抑制剂，其可有效抑制耐药菌产生，使已对阿莫西林耐药并产生β-内酰胺酶的细菌仍然对阿莫西林敏感[1].阿莫西林克拉维酸钾咀嚼片临床上用于因β-内酰胺酶流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌所致的下呼吸道感染、中耳炎、鼻窦炎的治疗，以及产β-内酰胺酶金葡菌和产酶肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属所致的尿路和皮肤软组织抗感染等[2].目前，阿莫西林克拉维酸钾咀嚼片注册标准中没有有关物质检查项，对此，本研究为了更好地控制其质量，参照阿莫西林克拉维酸钾片质量标准[3]中有关物质的测定方法，利用高效液相色谱法迅速、准确、灵敏度高与专属性强的特点[4-5]对阿莫西林克拉维酸钾咀嚼片中的有关物质进行测量.

1　材料与仪器

1.1　材　料

实验所用材料包括：阿莫西林克拉维酸钾咀嚼片(批号，161001、161002、161003)，由四川制药制剂有限公司生产；杂质D(批号，56293，纯度≥92.3%)、杂质J(批号，R064U0，混合物)、杂质C(批号，39563，纯度≥96.3%)，由LGC公司生产；阿莫西林对照品(批号，130409-201512，纯度≥86.9%)、克拉维酸对照品(批号，130409-201307，纯度≥95.0%)、阿莫西林克位维酸系统适用性实验对照品(批号，130588-201202)，由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱纯、磷酸二氢钾为分析纯，由成都科龙化工试剂厂生产.

1.2　仪　器

实验所用仪器包括：5410/L-2455型高效液相色谱仪(Hitachi公司)；BP-210D型电子天平(Sartorius公司)，pHS-3C型酸度计(上海佑科仪器仪表有限公司).

2　方法与结果

2.1　色谱条件

实验色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0)，流动相B为0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0)—乙腈(20∶80)，检测波长为230 nm；先以流动相A—流动相B(98∶2)等度洗脱，待阿莫西林洗脱完毕后立即按表1流程进行线性梯度洗脱.

表1　梯度洗脱程序表

2.2　溶液配制

2.2.1供试品溶液配制.

取本品的细粉适量，加流动相A溶解(必要时冰浴超声5～10 min助溶)并稀释制成每1 mL中含阿莫西林(按C16H19N3O5S计)2 mg的溶液，滤过，取续滤液，作为供试品溶液.

2.2.2对照溶液配制.

精密量取供试液适量，用流动相A定量稀释制成每1 mL中含阿莫西林(按C16H19N3O5S计)40 μg的溶液，作为对照溶液.

2.3　系统适用性及杂质定位

精密称取阿莫西林克拉维酸系统适用性实验对照品，加入流动相A溶解并稀释制成每1 mL中约含阿莫西林2.5 mg的溶液，作为系统适用性对照品溶液，取20 μL注入液相色谱仪，连续进样6次.结果见表2、3及图1、2.

表2　阿莫西林克拉维酸系统适用性实验峰面积结果

表3　阿莫西林克拉维酸系统适用性实验峰保留时间结果(min)

精密称取杂质C、杂质D、杂质J对照品适量，分别加入流动相A溶解并稀释制成每1 mL含上述杂质1 mg的储备液.精密量取储备液适量，分别加流动相A稀释制成每1 mL含上述杂质0.1 mg的定位溶液，各取20 μL注入液相色谱仪，结果见表4.

实验数据显示，记录的色谱图与标准图谱一致，且阿莫西林、克拉维酸及各杂质主峰峰面积的RSD%小于2.0%、保留时间RSD%小于1.0%，定位溶液的主峰与系统图谱中相应杂质峰的保留时间一致.结果表明，该色谱条件下的系统适用性良好.

图1阿莫西林克拉维酸制剂有关物质用标准谱图

图2阿莫西林克拉维酸系统适用性对照品溶液图谱

表4　定位实验结果

2.4　专属性实验

取本品(批号，161001)10片，精密称定，研细，分别精密称取细粉适量，再进行强酸、强碱、氧化、高温和光照破坏性实验.分别精密量取上述溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表5及图3.

表5　阿莫西林克拉维酸有关物质专属性实验结果

从表5和图3可知：空白溶剂和空白辅料无干扰；在各破坏条件下，阿莫西林峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，克拉维酸峰与相邻杂质峰之间的分离度虽小于1.5，但与阿莫西林克拉维酸钾系统适用性图谱一致；降解平衡在90%～100%之间.因此，在本条件下系统专属性良好.

图3未破坏样品HPLC图谱

2.5　检测限与定量限确定

取阿莫西林、克拉维酸钾、杂质C与杂质D对照品适量，加入流动相A溶解并稀释制成每1 mL含阿莫西林2 mg、克拉维酸钾0.3 mg、杂质C 0.1 mg、杂质D 0.1 mg的储备液.精密量取各储备液适量，加流动相A稀释制成一定浓度的溶液，取此溶液20 μL进样，记录色谱图，计算信噪比，以信噪比约3∶1为检测限，以信噪比约10∶1为定量限.检测结果为：阿莫西林、克拉维酸钾、杂质C与杂质D检测限分别是0.06 μg、0.012 μg、0.06 μg与0.013 μg；定量限分别是0.55 μg、0.04 μg、0.551 μg与0.062 μg.

2.6　线性范围考察

取“2.5”项下阿莫西林、克拉维酸钾、杂质C与杂质D储备液适量，置同一量瓶中分别用流动相A稀释至适宜的浓度，作为线性供试品溶液，分别精密量取各线性溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图.以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线.结果显示：阿莫西林杂质C在浓度为0.11～105.74 μg/mL范围内，进样20 μL，其峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性方程式为，Y=39.335x+4.4896，R2=0.9999；阿莫西林杂质D在浓度为0.10～97.38 μg/mL范围内，进样20 μL，其峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性方程式为，Y=30.0364x+5.9779，R2=0.9999；阿莫西林在浓度为0.11～105.15 μg/mL范围内，进样20 μL，其峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性方程式为，Y=30.0343x+4.8544，R2=0.9999；克拉维酸在浓度为0.10～101.94 μg/mL范围内，进样20 μL，其峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性方程式为，Y=23.5674x+5.0952，R2=0.9999.

2.7　准确度实验

精密称取研细后的本品细粉各65.7 mg，共10份，置于10 mL量瓶中.1～3号精密加入杂质储备液(含杂质C 0.1 mg/mL、杂质D 0.2 mg/ml)0.5 mL，作为50%的供试品样；4～6号精密加入杂质储备液(含杂质C 0.1 mg/mL、杂质D 0.2 mg/mL)1 mL，作为100%的供试品样；7～9号精密加入杂质储备液(含杂质C 0.1 mg/mL、杂质D 0.2 mg/mL)1.5 mL，作为150%的供试品样；10号作为未加杂质的供试品样.分别向1～10号加流动相A至8 mL，冰浴超声提取10 min，取出，放至室温，加流动相A至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液.

取杂质储备液适量，加入流动相A稀释制成每1 mL中约含杂质C 0.01 mg、杂质D 0.02 mg的溶液，作为对照品溶液；另精密量取各供试品溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液.

取上述对照溶液、对照品溶液和供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪分别测定.分别按外标法、自身对照法计算各杂质含量.结果显示：采用自身对照法测定咀嚼片中阿莫西林杂质C的平均回收率为121.28%，RSD为2.9%，杂质D的平均回收率为94.98%，RSD为4.3%，回收率不符合要求；采用外标法测定咀嚼片中阿莫西林杂质C的平均回收率为98.72%，RSD为2.4%，杂质D的平均回收率为96.98%，RSD为2.4%，各杂质的回收率均在90%～100%之间，RSD小于5.0%，回收率良好，准确度符合要求.

从两种方法测定的杂质含量的数据可看出，自身对照法测定的杂质含量值均大于或相当于外标法测定的杂质含量值.因此，采用自身对照法测定杂质含量，仍能很好地控制本品中的杂质限度，其方法是可行的.

2.8　精密度实验

2.8.1重复性实验.

精密称取研细后的本品细粉各65 mg共6份，分别加流动相A至8 mL，冰浴超声提取10 min，取出，放至室温，加流动相A至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液.另精密量取供试液1 mL，置50 mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液.

取上述对照溶液和供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪分别测定，分别按自身对照法计算各杂质含量，6份样品测定含量基本一致，RSD%均小于10.0，说明重复性良好.

2.8.2进样精密度实验.

精密称取研细后的本品细粉66.66 mg，加流动相A至8 mL，冰浴超声提取10 min，取出，放至室温，加流动相A至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液.精密量取供试液1 mL，置50 mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液.

取上述对照溶液20 μL，连续进样6次，记录色谱图，对照溶液6次连续进样各成分峰面积RSD%均小于1.0，说明进样精密度良好.

2.8.3中间精密度实验.

由不同分析人员在不同时间、不同仪器上取重复性实验项下细粉6份，同法测定.结果显示，同一样品由不同人员在不同时间、不同仪器上重复测定12次，RSD%的含量均小于20.0，说明中间精密度良好.

2.9　稳定性实验

精密称取研细后的本品细粉64.17 mg，加流动相A至8 mL，冰浴超声提取10 min，取出，放至室温，加流动相A至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液.精密量取供试液1 mL，置50 mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液.分别在0、2、4、6、8 h取供试品溶液及对照溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按自身对照法计算各杂质含量.结果显示：同一样品，对照溶液分别在0、2、4、6、8 h内连续进样，各杂质和主峰面积均无明显变化，峰面积RSD均小于1.0%，对照溶液在8 h内稳定；供试品溶液杂质含量随时间推移在不断增加，但在2 h内变化较小，8 h内虽然增加，但在仍标准规定的范围内.因此，对本品有关物质的测定最好在样品配制2 h内进样.