纸基微流控芯片的研究进展及趋势

吴　静　徐军飞　石聪灿　何明辉　陈广学　田君飞

(华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州，510640)

1　纸基微流控芯片的起源

微流控芯片技术是一种利用微米或亚微米通道控制微量(10-18～10-9L)的液体样品或检测剂，进行生化分析或医学诊断的技术。这项技术最初起源于20世纪70年代末，Terry等实现了缩微的气相色谱在硅片上的构建，并演示了其进行混合气体成分分析的效果[1]。随后，在20世纪90年代初，Manz等首次提出微全分析系统(Miniaturized Total(Chemical) Analysis Systems，μ-TAS)的概念[2]，该系统又被称为Lab on a Chip(LOC)。微流控芯片作为微型全分析系统的核心技术，它将生物化学分析过程构建在一个几平方厘米甚至更小的芯片上，通过微流通道控制试剂的输送，实现样品的制备、反应、检测等操作，在医学诊断、环境监测、生化分析等领域极具应用潜力。目前，微流控芯片已经发展成为世界上最具代表性的微集成化技术之一。

以纸张为基底构建检测平台有着诸多优点：造价低廉、环境友好、易于加工、可回收/再生、生物样品相容性较好、过滤特性良好、可降解等。此外，由于纸张具有多孔亲水性的特点，在仅有毛细管力的作用下即可实现样品或试剂流体的输送[3]。利用纸张制作多孔实验板和纸基检测芯片并用于化学分析的概念可以追溯到19世纪三四十年代[4- 5]。早在1949年，Muller等就开展了类似于微流控技术的工作，他们通过印制热熔蜡的方式制作了用于洗脱混合颜料的纸基检测装置[5]。而第一个用于半定量检测尿液中的葡萄糖的纸基传感器出现在19世纪50年代[6]；这项发明进一步发展为免疫纸基检测装置，并逐渐实现产业化。从2007年起，Martinez等提出的用于检测葡萄糖和蛋白质的多通道纸基微流控芯片[7]，激起了新一轮利用纸张设计微流控诊断器件的研究热潮。

2　纸基微流控芯片的工作原理、方法以及所用疏水性材料

纸基微流控芯片的工作原理就是在亲水的纸基上制作图案化的疏水边界，从而形成微流通道来控制液体的输送，进行一步或多步生物化学反应过程，进而完成整个检测诊断的过程。图1列出了几种纸基微流控芯片制作方法的示意图[8]。

根据疏水性物质与纸张结合的方式可以将微流通道的制作方法分为3类：物理阻隔法、物理沉积法和化学改性法。其中，物理阻隔法是将疏水性物质如光刻胶[9]或聚二甲基硅氧烷(PDMS)等浸渍到纸张中，阻隔纤维阵列的空隙来达到疏水的效果；物理沉积法是将蜡、聚苯乙烯(PS)等疏水物质沉积在纤维表面，通过降低纸张的表面能，使液体更倾向于渗透到亲水通道内，从而实现控制液体输送的效果。

图1　不同纸基微流控芯片的制作方法

2种方法都是通过疏水物质与纤维的物理作用从而改变纸张的润湿性能。而化学改性法则是通过使用烷基烯酮二聚体(AKD)等能与—OH亲水基团发生反应的试剂，在纤维素分子链上引入疏水基团，使纸张形成疏水界限。

3　纸基微流控芯片的结构

纸基微流控芯片的结构可以分为二维和三维两类。二维的纸基微流控芯片主要是在平面上设计微流通道以完成检测分析的过程，目前报道的大部分纸基微流控芯片都是基于二维平面的设计。图2列举了部分利用不同方法制作的二维纸基微流控芯片的示例[7,10- 14]。

二维纸基微流控芯片结构简单，制作方法便捷，但使用效果可能存在一些缺陷。例如液体在流动过程中残留在毛细管内或者挥发会导致传输效率低，同时黏滞力会严重影响液体在微通道内的流动，继而影响检测效果。为了解决这些问题，Tian等设计了V形凹槽结构输送液体[15]，提高了液体的传输效率，同时还降低了样品在输送过程中由于毛细管力等作用发生色析分离的可能性。

相对于二维纸基微流控芯片，三维纸基微流控芯片能实现空间上的多层同步或不同步的反应。而在制作三维纸基微流控芯片时，关键在于实现层与层结合，并且使上下层特定的亲水区域之间保持连通。目前，主要有2种制作方法：①以层叠的方式依次将各层粘贴起来；②所有的层组合到一起后在外部使用夹子、黏合剂或者防护涂层使层与层之间接触。图3(a)所示为第一种方法制作。该芯片由Wang等设计，他将4层色谱纸使用双面胶粘在一起，在各层打孔并加填纤维素粉达到层与层之间的连通，通过添加不同的反应剂对反应区域进行预处理，实现了镉、铜、铬、镍金属离子的有效检测[16]。图3(b)中由Liu等设计的用于检测葡萄糖和蛋白质的三维纸基微流控芯片则主要使用第二种方法制作，该芯片实现了样品的水平和垂直输送[17]。

4　纸基微流控芯片的检测方法

纸基微流控芯片可以集成多种检测方法，例如比色法[18]、电化学法[19]、化学发光法[20]以及电化学发光法[21]等。其中比色法应用最广泛，在健康诊断、生化分析以及环境检测领域有着巨大的应用潜力，可分析尿液中的葡萄糖、蛋白质、尿酸、酮类，检测乳酸、pH值、致病菌[22]、亚硝酸盐和ABO抗原等，测定碱性磷酸酶或过氧化物酶等的酶活，以及定量或半定量分析环境中重金属的含量及浓度。电化学法也可以用于检测葡萄糖、尿酸、乳酸、金属离子如铅、金等，此外，还被报道用于健康诊断中抗坏血酸、胆固醇和总铁量的检测以及测定食品中乙醇的含量。而化学发光法和电化学发光法，也曾分别被报道用于葡萄糖、尿酸的检测和生物医疗中烟酰胺腺嘌呤三核苷酸[23]等多种样品的检测。

2.2 统计学教学中的“去数学化” 前已述及，统计学的内核在统计思想，而统计学方法本身呈现给我们的是抽象的数学符号。面向数理功底较差的学生授课时，如何在讲解中，将统计方法“去数学化”显得很重要。所谓的“去数学化”实际就是将统计方法呈现给我们的抽象数学形式，转换成我们易于理解的语言过程。“去数学化”也是对统计方法背后的统计思想的进一步细化和具体化。我们以因子分析为例来说明“去数学化”的重要性。

图2　利用不同方法制作的二维纸基微流控芯片

图3　2种三维纸基微流控装置[16- 17]

5　纸基微流控芯片的不足及改进措施

纸基微流控芯片由于具有体积小、携带方便、检测快速准确等突出的优势，因此特别适合在资源有限的地区或家庭式的床边检验中使用。但是纸基微流控芯片的性能、使用以及存储等方面仍存在一定的不足，例如，灵敏度不高、普通用户的使用障碍、结果读取仍需要外部设备、由于存储条件差导致的货架期短或稳定性不佳等问题。为了突破这些瓶颈，一些研究小组对纸基微流控芯片进行了改进，下面从5个方面进行介绍。

5.1　提高纸基微流控芯片的灵敏度和特异性

从2007年起，大量的研究致力于研发能够高效、灵敏分析复杂样品的纸基微流控芯片，提高芯片的灵敏性也成为研究的一个重要部分[24]。Hossain等采用将分析试剂与溶胶凝胶衍生物相结合的方法，检测到了牛奶和蔬菜中浓度很低的有机磷酸农药残留[25]。Zhao以及Shiroma等分别基于比色法和电化学法提高了纸基微流控芯片检测的灵敏度和选择性[26- 27]。Sun等将分子印刷和照片电化学技术相结合，为五氯苯酚的检测提供了敏感且特定的平台[28]。这些纸基诊断的研究可以达到较高的灵敏度和特异性，但是其中一些必须依赖既昂贵又耗时的先进复杂设备的支持。

5.2　简化纸基微流控芯片的操作过程

大多数诊断测试，在不同试剂之间反应时需要多步过程，因此需要技术人员来操作。然而，对于非专业用户，有必要探索更加满足用户友好需求的设计。研究人员通过以下几个方面的研究，进一步简化了纸基微流控芯片的操作使用流程。

5.2.1控制纸张的润湿条件和液体的输送速度

纸张中液体输送的速度可以通过利用不同的材料对纸张进行处理，设计不同尺寸的通道以及引导液体在纸张上垂直流动或横向流动等方法来控制。Jahanshahi等分别通过使用胶片覆盖纸张上的亲水通道和用支链淀粉建立胶片桥的方法提高和减缓液体的传输速度来控制反应的时间[29]。Schonhorn等设计了一种控制方法，通过限制液体在3D芯片中沿垂直和横向通道输送，来控制逐步反应和清洗的时间[30]，从而简化了多步顺序即时检测实验的操作要求。Giokas等使用了类似的方法满足了多步实验和时间控制的需求[31]。Akyazi 等在纸基微流控芯片上使用离子凝胶来实现液体在纸基通道中流动延缓的控制[32]。这些可控机制可以实现选择性或者顺序性地引导试剂进入纸基微流控芯片传感区域，从而减少了用户参与检测过程的需要，增加了芯片的用户使用友好性。

纸张表面改性也可以用来设计时间可控的纸基芯片。Lutz等利用可溶性的糖对微流体通道进行功能化并通过简单的纸张折叠来实现样品传输的时间延缓的控制[33]。Jahanshahi等使用改性的纸张设计了一种用户友好并无需设备的传感器来检测杀虫剂[29]，使得在可控的情况下减缓样品在纸基通道中的流动。

相比二维纸基微流控芯片，三维纸基微流控芯片使得实验过程对于用户更加容易且无需特定的仪器，因此可以使用可折叠的纸张制作操作简单的芯片。Fridley等制作了一种功能化纸片并用于检测疟疾[34]。完成这项检测，用户只需添加样品和水以激活干燥的试剂，然后关闭卡片，横向射流通道使样品输送到不同的反应和检测区域。通过这项技术，用户可以通过一步操作实现多步测试。另外，Jayawardane 等通过使用锌微粒将硝酸盐转换为亚硝酸盐沉积在纸基通道中，实现了同一芯片亚硝酸盐和硝酸盐的同步检测[35]。

图4　基于时间测量和计算彩色条数目设计的纸基传感器[43- 44]能够简化测试结果的读取

5.2.3提高纸基微流控芯片对样品的预处理能力

为了简化纸基微流控芯片的操作过程，需要加强芯片自身进行样品预处理的能力(例如净化、离心、分离)。Pollock等报道了一种使用蜡印花纹纸设计样品传输通道用来半定量分析血清转氨酶的集成3D纸基传感器[36]，用户仅需将样品引入样品区，然后读取比色结果。该方法能够很好地分离抗体阳性红细胞，但对于抗体阴性红细胞的分离效果不佳。Nilghaz等使用浓度比生理缓冲液浓度高50%的盐溶液从全血中分离血浆[37]，该方法适用于所有类型的红细胞。Noiphung等报道了一种结合等离子隔离芯片的电化学纸基微流控芯片，将样品的预处理芯片整合到芯片上，成功地用于全血样品中葡萄糖浓度的测定[38]。另外，Connelly 等还介绍了“纸质机器”的概念[39]，通过使用环介导等温扩增法设计传感器，用于细胞的分析、DNA的分离和样品的制备等。他们的设计都大大减少了用户在使用芯片时的工作。

5.3　提高结果读取技术

纸基微流控芯片另一个需要更多研究的重要方面是结果的读取和解释，为了尽可能简单和清晰地将结果展示给用户，提高比色分析的量化能力已经成为纸基微流控芯片研究的目标。

除了计数和计时的方法之外，长度测量的半定量法[45]是一个简单的概念，操作过程更简单方便。Cate等报道了一种通过使用尺子测量通道中指示颜色变化长度取代色强度测量的半定量方法[46](图5a)，长度的测量可以在不同的光照条件下进行，而且可以获得比比色测量法更一致的结果。Wei等同样利用基于长度的量化方法检测了尿液中的可卡因[47]。目前，该传感器已经经过优化，可用于酶、无机离子以及诸如腺苷等小分子物质的定量分析。基于使用尺子测量长度以及彩色条计数和时间测量的传感器的设计在很大程度上简化了测试结果的解释，使之更清晰明了地呈现给用户，达到了用户友好的要求。

此外，为了实现用户无需打印校正曲线就可以实现检测的目的，Wang 等设计了一种可以检测分析物样品同时提供校正曲线的传感器[48]，用户可以不需要打印的校正曲线随时读取结果。这一研究成果减少了用户在使用传感器时的工作，同时满足了检测物的定量检测和分析。

结果显示的文本化进一步提高了结果解释的简易性。在血型研究中，纸基传感器根据细胞的凝集情况，使用生物活性和非生物活性的字母或符号，例如“A”“B”“C”和“+”进行图案化来鉴定人的血型[49](图5b)。另外，还可以利用指示剂与金属离子反应形成的具有特定颜色的复合物在纸张上进行图案化形成目标金属的化学符号表达检测结果。Li等已成功将该方法用于铜、铁、镍离子的检测(图5c)。使用文本报告的方法对金属离子进行检测和量化有一个很明显的优势。这是因为一些金属离子-指示剂复合物具有相似的颜色，那么对于用户来说，用化学符号读取测试结果比用不同却相似的颜色读取要更容易一些[50]。

图5　为了提高纸基微流控芯片的用户友好性和无需设备特性而设计的几种不同的结果读取技术的示意图[45，49- 51]

图6　使用夹心法将生物分子固定在纸张上以提高其稳定性[52- 53]

除了以上技术，Wei等研制出一种采用目标-响应水凝胶系统作为障碍开关来开关样品通道的纸基微流控芯片[51]。这项技术通过“on”和“off”信号展示了样品中可卡因、腺苷以及铅离子的可视化鉴定(图5d)。

5.4　延长纸基微流控芯片的保质期，提高其稳定性

为了保证纸基微流控芯片在资源有限或存储条件较差的地区正常使用，纸张表面生物分子和化学试剂的稳定性以及芯片保质期的研究至关重要。

延长纸基微流控芯片保质期的途径主要可以分为2种，一种是将试剂进行处理，使之与其他物质混合或直接包裹试剂制成胶囊，达到与外界隔离的效果；另一种是改进芯片的材料，将纸张进行处理以提高与生物分子的相容性，使之能够更好地保存试剂。例如，Mitchell等将聚乙二醇和石墨与辣根过氧化物酶通过研磨法混合均匀，挤压成柱状，制成试剂铅笔用于检测葡萄糖的浓度，研究发现，试剂铅笔不但可以有效地达到实验效果，而且在常温常压条件下存储63天后酶的活性未出现明显的下降[52]。另外，将生物分子例如酶包裹在水解或浓缩的二氧化硅溶胶-凝胶基质材料或其他阴阳离子聚合物中也能很好地提高生物分子的稳定性，并可以实现生物分子的多层封装(图6a)。Yamada等使用喷墨印刷逐层打印叠层结构(图6b)，通过夹心法将酪氨酸酶置于阳离子壳聚糖和阴离子藻朊酸盐之间[53]，结果证明，酪氨酸酶在室温下存储260天后仍有92%的酶保持良好的活性。此外，Jahanshahi等报道生物分子的活性可以通过支链淀粉的使用得到很好的保护[54]。以上方法均基于对试剂进行处理从而实现其稳定性的提高。

而在针对装置进行改进方面，Guan等探索了延长纸基微流控芯片上IgM抗体生物活性保质期的不同方法[55]。结果发现，在没有保护的情况下，滤纸上抗体的生物活性会迅速下降，但活性丧失的速度可以通过使用聚合物添加剂例如甘油等的保护以及冻干处理而显著减缓。这项研究表明，在分子水平上抗体分子的保护对于生物活性传感器是必要的。Jayawardane等也开发了一种用于检测自然中和污染水体中铜的纸基传感器[56]，该装置的性能在4个不同的条件储存了超过5个月之后并未观察到恶化。Zhang等报道了一项用于细菌检测的试纸条设计的研究[57]；他们展示了该试纸条在-18℃的条件下储存超过12个月仍可以保持相同水平的活性。然而，为了使该传感器在发展中地区更有用，还需要研究如何放宽传感器的存储条件。除了上述研究，文献还表明纳米微粒的使用可以提高纸张上某些化学药品和试剂的稳定性。这些概念已经由Liu 等提出来，他们开发了一种使用ZnFe2O4-多壁碳纳米管检测癌胚抗原的纸基免疫传感器[58]。他们表示，与现有的技术相比，纳米复合材料提高了一些酶的稳定性。文献也表明，使用干试剂而非试剂溶液可以帮助放宽传感器的存储条件，消除了冷冻链的需要，而且使传感器的保质期更长。

5.5　增加纸基的附加功能，赋予纸基微流控芯片的特异性

由于很多待测样品都携带了复杂和不均匀的微粒和高分子，为了分析这些样品，纸张的附加功能，例如特定微粒尺寸范围的分离、过滤、抗体蛋白吸附等都是需要的，因此需要对纸张进行特定的设计，例如制作生物活性纸等。Deng等使用聚乙二醇对纸张表面进行改性来减少纸张上的非特异性蛋白吸附[59]，结果表明，与未被改性的滤纸相比，表面改性后的纸基酶联免疫吸附测试的性能显著提高。而Wang等指出，使用壳聚糖改性的纸张的敏感性和特异性提高[60]。Zhang等通过在纸浆中加入含有指示剂和颜色增强剂的孵化微胶囊制作了一个生物活性传感器来测定与唾液酸酶相关的疾病[57]，结果显示，由于纸张功能性的提高颜色也随之增强了。另外，根据Li等的报道可知，纸张的纤维组分和厚度会影响红细胞在纸张纤维网络结构上的传输[61]。这些研究人员使用压汞孔隙率测定法来分析由不同纤维组成的纸张上毛细孔的结构，并评估了红细胞在纤维网络结构内部的传输[62]，研究表明，自由红细胞和凝集红细胞簇的分离会通过造纸过程中纤维网络结构的控制而得到显著提高。

6　结语及展望

纸基微流控芯片已集中研究了近10年，其应用涉及生物化学分析、医疗诊断、环境监测等多个领域。研究人员使用纸张作为基材制作分析装置，最初目的是为了充分利用这种来源广泛的材料，来制作一种适用于低资源配置的国家和地区使用的分析检测平台。根据世界卫生组织的要求，此类快速检测不但要求成本低廉、反应灵敏、结果相对准确，而且要便于使用，从而减少用户在操作过程中的工作，使得非专业用户在没有专业援助的情况下能够完成实验并获得明确的解释测试结果；另外，增强装置的稳定性、延长其保质期也是必不可少的要求。目前，尽管该领域的部分研究成果能够满足实际使用的要求，但大多数的纸基微流控芯片依然停留在实验室阶段，因此围绕纸基微流控芯片市场化的技术开发仍需进一步探究，以促进技术的改进和革新，建立具体的技术标准，从而实现工业制造与商业化。