优良玉米单倍体诱导系丹诱3号的选育与应用

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(丹东农业科学院，　辽宁 凤城 118109)

从20世纪50年代单倍体技术在玉米遗传育种中使用以来，该项技术被逐渐认可并得到广泛应用。美国、德国和俄罗斯等国家在单倍体技术方面应用较早，先后选育出一批诱导系并选育出诸多优良品种。我国尽管起步较晚，但是在该领域研究方面也取得了长足的进步，中国农业大学玉米改良中心和吉林省农业科学院玉米研究所先后选育出一批优良的单倍体诱导系，并成功选育出一系列优良玉米自交系。从当前全国玉米育种发展趋势来看，利用单倍体选系技术已成为玉米自交系选育的主要方法，单倍体技术可以有效地提高育种效率，使自交系纯合速度从常规的6～8代缩短到2代。而且该项技术对拓宽种质资源、纯合繁殖整理、寻找基因突变等都有很好的利用价值。

丹东农业科学院在玉米自交系选育方面也在不断的探索和尝试新途径和新方法，对单倍体技术非常重视，特聘请美国巴斯夫公司首席遗传学科学家、美国农业部前高级顾问、单倍体育种专家张铭堂先生作为技术顾问，期望在单倍体诱导系和单倍体育种方面有所突破和创新。进入2000年以后，丹东农业科学院先后引进一系列诱导系材料，如Stock 6、高诱1号、高诱5号和铭堂1号等，这些诱导系在不同时期、不同育种单位得到广泛的应用。每个诱导系都具有一定的生态适应性和试验材料亲和性，在使用的过程中发现，由于环境和材料的差异，上述一些外引诱导系存在熟期差异过大、繁殖困难、对资源诱导率较低等诸多不利因素。因此，如何选育抗病、抗逆、自主、适合丹东地区生态气候的诱导系是育种工作的重要课题。根据单倍体育种的需要，确定了诱导系选育、利用和创新研究的目标。利用外引诱导系并结合地方资源，通过杂交、三交、复合杂交、诱导加倍等方法，在丹东、三亚特定的环境背景下选育丹诱系列诱导系，丹诱3号就是在这样技术思路中选育而成的优良单倍体诱导系。

1　丹诱3号的选育过程

丹诱3号是丹东农业科学院2004年以玉米诱导系Stock 6和普通玉米自交系T 68为基础材料组建二环系，经过连续3代自交后，通过杂交导入ig基因，又复合杂交高诱1号，再经过单倍体诱导的方法选育而成的玉米诱导系。利用单倍体诱导加倍方法选育玉米自交系已经是一项非常成熟的自交系选育技术，该方法简单且效率高，可以有效地缩短育种周期、加速育种进程、提高育种效率。但该育种方法的短板在于缺少诱导率高、综合性状优良的玉米诱导系。在应用外引成型诱导系的过程中，总是有诸多不足之处，比如诱导率低、植株弱小、花粉量小、繁殖困难等。如果能够在诱导系方面有所突破，将能提高单倍体育种方法的资源利用率和育种目标精准度。选育自有优良诱导系思想的指导下，进行了丹诱3号基础试材的创建。

Stock 6来源于美国Northrup King种子公司，20世纪50年代该公司发现了一个能够高频率诱发单倍体的早熟白色硬粒型玉米材料，由于当时不具有育种实际价值，将这份材料送给威斯康辛大学作为遗传资源研究之用。1956年该校在校研究生Ed Coe发现这份材料有利用价值，并将R-nj基因导入其中，后来又将形成紫色叶片、茎秆、雄穗和花药的几个显色基因导入，分别经过2次回交和自交，育成现在的Stock 6。Stock 6表型为果穗籽粒白色硬粒型，籽粒冠顶有紫色斑块，胚芽紫色，植株具有较深的叶片、茎秆、雄穗和花药，具有三重性状标记的特性，以Stock 6作为父本，将花粉授精到绿色植株黄色籽粒的普通玉米花丝上，可根据杂交结实的籽粒胚乳、冠顶、胚芽和植株颜色4方面表型性状进行鉴定，区分二倍体或单倍体籽粒及植株，Stock 6是最早的单倍体诱导系。

自交系T 68来源与Lancaster类群自交系C 103和旅大红骨类群丹340的二环选系，具有茎秆粗壮、抗性突出、雄穗发达、花粉量大和配合力高等特点，2003年冬在海南T 68的繁殖整理过程中，收获脱粒时发现其中1个果穗具有多胚现象，即1个籽粒中出现2～3个胚芽，以双胚居多，多胚率达到10%左右，后将其单独保存，作为独特遗传资源进行研究。受到单倍体Stock 6选育过程的启发，T 68多胚种子的不确定性是否能够对单倍体的形成起到正向促进作用，在期待实现对Stock 6农艺性状进行有效改良并提高其诱导率的选育目标指导下，组建了Stock 6×T 68基础材料。

2　丹诱3号的特征特性

2.1　生育期与形态特征

丹诱3号在丹东地区生育期110 d左右，在海南三亚生育期78 d左右，全生育期较其它同类玉米单倍体诱导系晚4～5 d。种子芽势强，出苗整齐，苗期生长势强，幼苗第1片叶呈卵圆形，叶鞘紫色，叶缘无色。成株叶鞘紫色，叶片绿色，茎节红色，株型半紧凑，株高166.5 cm，穗位65.5 cm，全株18～19片叶，雌穗苞叶带有紫色条斑，穗柄中等，苞叶略长，花丝紫红色，雄穗分枝数5～8个，花药黄色，护颖红色，颖壳底部有紫色环形底座。果穗筒型，秃尖小，穗长15.8 cm，穗行数14～16行，单穗籽粒250～300粒，高者可达350粒以上，穗轴白色，籽粒白色带有紫色冠顶，标记性状明显，粒型半马齿型。

2.2　诱导特性与诱导率

丹诱3号诱导标记性状清晰明显，可以根据被诱导材料籽粒胚乳颜色、籽粒冠顶颜色、胚芽颜色及播种后田间植株颜色几方面综合鉴别。区分杂交籽粒、自交籽粒、二倍体籽粒、单倍体籽粒或植株。以普通黄色玉米材料为例，通过丹诱3号诱导以后，如果籽粒顶部和胚芽都具有紫色标记性状即为杂交籽粒；如果籽粒顶部和胚芽都无紫色标记性状呈深黄色即为自交籽粒；如果籽粒具有紫色冠顶而胚芽无标记紫色即为单倍体籽粒。从田间表现来看，如果植株矮小瘦弱，叶片和叶鞘呈正常绿色，即为来自于被诱导母本材料的单倍体植株；如果植株矮小瘦弱，叶片和叶鞘呈紫或红色，即为来自于丹诱3号的单倍体植株；如果植株高大健硕，叶片和叶鞘呈紫或红色，即为杂交植株；如果植株生长势介于单倍体和杂交植株之间，即为单倍体自然加倍形成的二倍体植株，这种情形的概率较低。丹诱3号的诱导率较高，在正常的自然环境条件下，平均诱导率介于10%～15%之间。与其它诱导系相比，丹诱3号对旅大红骨材料的诱导率明显提高，这是该诱导系的主要优势。

2.3　栽培与繁殖技术

丹诱3号适宜平肥土地以上肥力土壤环境下种植，土壤肥沃、合理肥水条件下能够获得更高产量。空间隔离要求繁殖田块具有500 m以上的隔离距离，时间隔离要求开花散粉时间前后间隔30 d以上。辽宁地区通常在4月30日至5月10日之间播种为宜，种植密度为3 500～4 000株/667 m2。底肥施农家肥1 500 kg/667 m2，口肥施磷酸二氨20 kg/667 m2，拔节期追施尿素30 kg/667 m2。苗期、拔节期、抽雄前期进行严格去杂去劣，保证纯度。为保证充分授粉、结实优良，可按5∶1比例错期播种。

3　丹诱3号技术创新情况

3.1　整合优势诱导材料，实现优良基因的累加聚合

丹诱3号是利用Stock 6×T 68为基础试材，再复合杂交W 23 ig和高诱1号，利用单倍体技术选育的优良诱导系。Stock 6是目前所有单倍体诱导系的最原始基础材料，保留着高频率诱发单倍体的遗传基因；T 68是包含兰卡斯特和旅大红骨种质资源且具有多胚性状的优异试材；W 23含有不定胚ig基因，本身能够实现单倍体转化；高诱1号是中国农业大学国家玉米改良中心研发的国内优良诱导系。这些材料基因多样性丰富、遗传背景远缘，构建基础试材能够实现优良基因的累加和聚合，达到选育诱导率高、应用性广、性状优良，而且包含有丹东地区独特的旅系资源，更适宜选育辽宁本地区的优良诱导系。

3.2　在诱导系的基础上选育诱导系，创新选育方法

诱导系的选育有多种方法。通常利用二环选育方法，即利用诱导系间相互杂交后再连续自交，通过5～7代的自交最终筛选的新诱导系的过程，该方法简单实用，但选育过程周期长、受环境影响较大，由于诱导材料本身抗逆性弱，在选育过程中易发生试材淘汰流失；还有利用回交选育方法，通常对某个不良性状进行改良修饰，利用诱导系与具备优良改良性状的自交系进行杂交，再利用被改诱导系进行连续回交选育，该方法简单行之有效，可以对不良性状进行有效改良，但是选育的新诱导系诱导率不会发生本质的提高，没有突破和创新。丹诱3号在选育过程中进行了大胆的尝试，由于单倍体诱导加倍选系技术本质是实现优异玉米试材快速成系的高效选育方法，应用在普通玉米自交系上可行，放在诱导系上也应该能够实现快速选系的目的，所以利用诱导系高诱1号对复合杂交试材进行诱导处理，最终经过诱导和加倍实现了诱导系丹诱3号的选育。

表1利用丹诱3号选育的自交系和杂交种情况

序号诱导自交系杂交组合品种名称审定情况1丹D18丹D15×丹D18丹玉505辽审玉20150512SD53SD53×SD09-6辽禾338辽审玉2015042354W54W×T36宏硕737辽审玉20150204g2g2×g57佳昌990辽审玉20150415F12W229×F12万育979辽审玉2015049

3.3　对环境反应钝化，在不同生态区域保持较高诱导率

目前应用的诱导系通常植株矮小、生活力低、农艺性状偏差，而且对温度、水分、光照和阴雨等不同气候环境反应敏感，导致对同一份诱导材料在不同的环境条件下诱导率差异显著。比如以先玉335杂交种作为被诱导材料，以高诱1号作为诱导系，诱导率在温光条件优越的新疆拜城和海南三亚可以达到10%左右，在温度较低、光照较好的哈尔滨为8%左右，而在温光条件均较弱的辽宁丹东地区仅有5%，目前应用的很多诱导系对环境反应较为敏感。通过对丹诱3号诱导系在不同地区的诱导试验研究发现，在阿克苏、三亚和海城诱导率在12%，最高接近15%，在双城和长春地区诱导率接近10%，在丹东诱导率也能达到8%～9%，可见丹诱3号对不同的生态条件反应钝化，表现出诱导率较高而且稳定的特点。

通常利用单倍体诱导加倍选育方法对旅系资源进行选择效果不理想，最主要原因表现为诱导率和诱导后籽粒辨识率较低，挑选后的单倍体籽粒在加倍过程中，田间伪杂株出现率较高，而且加倍率较低。利用丹诱3号进行相关的诱导和加倍研究，试验结果表现为对旅系及其含有旅系的综合选系诱导率提高到10%左右，有效地提高的诱导效率。分析提高诱导率的原因为自然环境选择的影响，因为丹诱3号是在丹东地区选育的诱导系，并且含有旅系资源，与旅大红骨资源在生长发育的自然环境方面有很好的吻合性，所以诱导率会有所提高。

3.4　导入不定胚ig基因，在提高诱导率的基础上，成功实现诱导系做母本的反向诱导

丹诱3号在系谱选育过程中导入不定胚ig基因，ig基因能够在初生胚发育过程中，消除卵原细胞分裂的准确信息，使得卵原细胞无法正常分裂形成8个细胞，或者不能抑制细胞的持续分裂，导致形成卵和极核数目不稳定，也影响了正常的双受精过程。在ig基因的作用下，通常每个果穗约有84%的正常籽粒，6%的多胚籽粒，7%的异雄核授精籽粒，3%的胚是单倍体。通过单倍体诱发基因和不定胚基因互作，实现单倍体诱导率的提高。含有ig基因的诱导系通常作为母本材料使用，丹诱3号果穗自身产量较高，表现为授粉籽粒结实良好，单穗籽粒数增加，进而尝试利用丹诱3号作为母本，取被诱导的材料花粉授在丹诱3号的雌穗花丝上，这样也打破了通常诱导系只能作为父本使用的诱导观念，实现反向诱导。实践证明，以丹诱3号作为母本诱导系诱导率也能达到10%以上，这种情况下可以保障在被诱导试材种子量很小或者及其珍贵的条件下，即对被诱导材料进行繁殖加代又同样实现诱导的目的，达到一举两得的理想效果。

4　丹诱3号的应用

丹诱3号诱导系在选育过程中，基础试材增加了旅大红骨种质资源的成分，有效地提高了试材的地方环境适应性，实现了诱导系本地化，改良过程采用了2次复合杂交，导入了不同诱导系的基因，增加了优良基因的累加和聚合，不仅改良了诱导系的农艺性状，也提高了诱导能力。据初步统计，丹诱3号选育至今由其诱导加倍成功的优良自交系达8个以上，组配的玉米杂交种有5个获得辽宁省审定(表1)。

4.1　玉米杂交种丹玉505的选育与应用

丹玉505是辽宁丹玉种业科技股份有限公司于2010年冬在海南以丹D 15为母本，以丹D 18为父本组配而成的单交种。父自交系丹D 18属旅大红骨种质，来源与S 122×DH 34组建基础试材，利用丹诱3号单倍体技术选育而成。2013—2014年参加辽宁省玉米品种晚熟组区域试验，2013年平均产量632.7 kg/667 m2，比对照丹玉39增产6.4%；2014年平均产量790 kg/667 m2，比对照沈玉21增产5.1%。2014年参加同组生产试验，平均产量783 kg/667 m2，比对照沈玉21增产5.3%。丹玉505春播生育期131 d，属晚熟型玉米杂交种，适宜中等以上肥力土壤栽培，适宜密度3 500株/667 m2，需在辽宁省内≥10 ℃活动积温在3 000 ℃以上的晚熟玉米区域种植。

4.2　玉米杂交种辽禾338的选育与应用

辽禾338是大连盛世种业有限公司以SD 53为母本，以SD 09-6为父本组配而成的玉米单交种，母本系SD 53利用丹诱3号单倍体技术选育而成。2013—2014年参加辽宁省玉米品种晚熟组区域试验，2013年平均产量639.0 kg/667 m2，比对照丹玉39增产7.5%；2014年平均产量843.4 kg/667 m2，比对照沈玉21增产11.9%。2014年参加同组生产试验，平均产量803.1 kg/667 m2，比对照沈玉21增产7.0%。辽禾338春播生育期133 d，属晚熟型玉米杂交种，适宜中等以上肥力土壤栽培，适宜密度3 500株/667 m2，需在辽宁省内≥10 ℃活动积温在3 000 ℃以上的晚熟玉米区域种植。

4.3　玉米杂交种宏硕737的选育与应用

宏硕737是丹东市振安区丹兴玉米育种研究所以54 W为母本，以T 36为父本组配而成的玉米单交种，母本系54 W利用丹诱3号单倍体技术选育而成。2013—2014年参加辽宁省玉米品种中晚熟组区域试验，2013年平均产量744.6 kg/667 m2，比对照郑单958增产7.3%；2014年平均产量859.9 kg/667 m2，比对照郑单958增产7.1%。2014年参加同组生产试验，平均产量820.3 kg/667 m2，比对照郑单958增产9.5%。宏硕737春播生育期128 d，属中晚熟型玉米杂交种，适宜中等以上肥力土壤栽培，适宜密度4 000株/667 m2，需在辽宁省内≥10 ℃活动积温在2 800 ℃以上的晚熟玉米区域种植。

4.4　玉米杂交种佳昌990的选育与应用

佳昌990是营口市佳昌种子有限公司以g 2为母本，以g 57为父本组配而成的玉米单交种，母本系g 2利用丹诱3号单倍体技术选育而成。2013—2014年参加辽宁省玉米品种晚熟组区域试验，2013年平均产量664.5 kg/667 m2，比对照丹玉39增产11.8%；2014年平均产量848.7 kg/667 m2，比对照沈玉21增产12.0%。2014年参加同组生产试验，平均产量868.2 kg/667 m2，比对照沈玉21增产14.7%。佳昌990春播生育期131 d，属晚熟型玉米杂交种，适宜中等以上肥力土壤栽培，适宜密度3 500株/667 m2，需在辽宁省内≥10 ℃活动积温在3 000 ℃以上的晚熟玉米区域种植。

4.5　玉米杂交种万育979的选育与应用

万育979是辽宁万孚种业有限公司以W 229为母本，以F 12为父本组配而成的玉米单交种，父本系F 12利用丹诱3号单倍体技术选育而成。2013—2014年参加辽宁省玉米品种晚熟组区域试验，2013年平均产量647.6 kg/667 m2，比对照丹玉39增产10.6%；2014年平均产量818.8 kg/667 m2，比对照沈玉21增产8.1%。2014年参加同组生产试验，平均产量823.3 kg/667 m2，比对照沈玉21增产11.0%。万育979春播生育期131 d，属晚熟型玉米杂交种，适宜中等以上肥力土壤栽培，适宜密度3 500株/667 m2，需在辽宁省内≥10 ℃活动积温在3 000 ℃以上的晚熟玉米区域种植。

丹诱3号选育至今，利用其选育的高配合力自交系13个，并组配审定杂交种8个，这些杂交种在辽宁各主要生态区广泛种植，截至2016年累计推广25.33万hm2，增产粮食9 500万kg，增创经济效益1.33亿元。今后这些品种和由其选育的后续品种的推广应用面积还会进一步增加。

丹诱3号的成功选育一定程度上改变了目前国内缺少地方性优良玉米单倍体诱导系的局面，可以说丹诱3号填补的丹东地区诱导系的空白。丹诱3号对不同血缘背景的种质资源诱导率较高，一般诱导率在8%～11%之间；通过单倍体技术大大提高了育种效率，能够缩短育种周期3～5年；单倍体育种还能有效增加育种目标的精准度，传统方法选育优良自交系的概率为万分之八，而单倍体方法选育优系的概率约为千分之二，成功过概率提高了2.5倍；因为缩短了育种周期，所以单倍体方法节省了土地、人力、肥料、农药、试验耗材等投入，降低了成本、节约了资源、保护了环境，实现了育种资源的充分利用和生态环境的友好保护。对丹诱3号进行知识产权保护的同时，也开放性的吸收外单位提供的优异基础材料进行诱导处理，利益分享达到合作共赢的效果，共同促进玉米育种技术进步和优良玉米新品种的研发创新，创造了良好的社会效益。

当今生物技术迅猛发展，单倍体技术在育种中的研究必将持续和深入。今后单倍体技术的工作重点应该是进一步完善单倍体诱导体系建设、提高诱导率、完善加倍技术、加强标记性状筛选研究。实现单倍体技术与常规育种、分子设计育种、转基因育种等多技术有机结合，加强新诱导系的选育研究，探索单倍体诱导的遗传机制，使单倍体育种技术发挥越来越重要的作用。