NtQPT基因对烟草形态及光合特性影响的研究

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(1.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院,山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室,　贵阳 550025;2.贵州省山地生态与农业生物工程2011协同创新中心，　贵阳，550025;3.贵州省农业科学研究院,　贵阳 550006)

喹啉酸核糖基转移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase,QPT)是烟碱(nicotine)结构中吡啶环合成的关键限速酶，不仅可催化喹啉酸形成烟酸单核苷酸(nicotinic acid mononu-cleotide,NAMN)，进而生成烟酸[1-2]，同时也调控了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的从头合成途径(de-novo synthesis)，在生物体的初生代谢中扮演重要角色[3-4]。QPT催化合成产物NAD可作为生物体内多种催化反应必不可少的辅酶，在三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)、电子传递(electron transport)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)等过程中也同样发挥着重要的作用[5]。目前，植物中QPT基因的研究多集中于其编码酶参与介导的烟碱生物合成与调控[6-7]。2000年，Sinclair等首次从普通烟草(Nicotianatabacum)和林烟草(Nicotianasylvestris)中克隆得到QPT基因，发现打顶和喷施生长素处理可分别上调和下调烟草QPT基因的表达[6]。之后，Xie等利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)干涉QPT基因，获得了低烟碱含量的转基因烟草植株[7]。另有研究报道，QPT对植物的生长发育及初生代谢的调控也同样发挥了重要作用[4]。Khan等的研究表明，烟草中QPT基因下调不仅降低了烟碱含量，还会显著影响烟草的株高、开花数及总叶绿素含量等形态及生理指标[8]。本研究分别构建了以 CaMV(cauliflower mosaic virus)35 S启动子启动QPT超量表达以及CaMV 35 S启动子驱动QPT干涉表达的植物表达载体pSH-35 S-QP-T和pSH-35 S-QPTi，分别利用农杆菌(Agrobac-teriumtumefaciens)介导的转化法对烟草进行遗传转化。通过测定和分析各生育期不同转基因烟草的形态及光合特性参数，研究QPT基因对烟草生长发育及光合特征指标的影响。为阐明QPT在调节植物生长发育过程中的作用及定向培育烟草新种质提供参考。

1　材料与方法

1.1　材　料

普通烟草(NicotianatobacumL.)栽培品种‘Xanthi’、农杆菌(A.tumefaciens)菌株 LBA 4404 和植物表达载体pSH 737 由本实验室保存并提供。T4DNA连接酶和DNA Marker 购于Takara 生物工程公司；植物DNA提取试剂盒购于天根生化科技公司；琼脂糖、乙醇等购于科密欧化学试剂公司。

1.2　方　法

1.2.1载体构建

超量表达载体pSH-35 S-QPT 由实验室保存并提供。QPT干涉表达元件由上海旭冠生物技术有限公司合成，参照赵丹等[9]的方法，用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切载体pSH 737 和干涉片段，然后连接转化得到 pSH-35 S-QPTi 载体。pSH-35 S-QPT载体和pSH-35 S-QPTi载体均含有35 S启动子驱动的GUS∷NPTⅡ 基因作为报告基因。

1.2.2遗传转化

通过冻融转化法[10]获得分别含有pSH-35 S-QPT 和pSH-35 S-QPTi 的工程农杆菌，以叶盘法[11]遗传转化烟草。并将得到的抗性植株幼苗移栽到施有底肥的营养土中，后期追肥1次。

1.2.3转基因植株PCR鉴定

取4～6叶期抗性烟苗的叶片进行GUS化学组织染色，提取GUS染色阳性植株叶片总DNA用于PCR鉴定。检测35S-QPT特异片段扩增引物：F-QPT：5′-CGCACAATCC-CACTATCCTT-3′；R-QPT:5′-TTAGAGCTTTGCCGACACCT-3′。干涉片段35 S-QPTi特异片段扩增引物：F-QPTi：5′-CGCACAATCCCACTATCCTT-3′；R-QPTi:5′-TTCGCCAGTAAGGTCCGTAA-3′。PCR扩增体系(20μL)：正反向引物(10μmol/L)各加1μL，Premix rTaq10μL，DNA模板1μL，dd H2O 7μL。混匀后，使用System 9700 PCR仪进行扩增反应。条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。反应结束后，取6μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4植株形态指标的测定

对移栽后长至团颗期、旺长期和开花期的转基因植株的形态指标，包括株高、叶片数、茎围、腰叶长和宽及叶面积等指标进行观察并记录。测定方法按烟草农艺性状调查标准方法(YC/T 142-2010)[12]进行。

注：RB为T-DNA右边界；35 S为CaMV 35 S 启动子；polyA为终止子；LB为T-DNA左边界。图1　pSH-35 S-QPT (A)和pSH-35S-QPTi (B)植物表达载体结构示意图

注：A～E为烟草遗传转化过程；F为转基因烟草烟草。图3　烟草xanthi的遗传转化

1.2.5光合特性参数及光响应曲线的测定

光合特性参数测定参照张笑寒等[13]的方法，利用Li 6400 XT光合仪在晴天条件测定移栽30 d左右的转基因烟草及其野生型的净光合速率(net photosynthetic rate,Pn)、气孔导度(stomatal conductance,GS)、胞间二氧化碳浓度(Intercellular carbon dioxide concentration,Ci)和蒸腾速率(transpiration rate,Tr)。测定时间为09：00—17：00时，每种类型选取3株，每次测定重复3次。光响应曲线的测定参照吕典华等[14]的方法，使用仪器配备的红、蓝光源进行测定。CO2浓度设置为 400μmol/mol，叶室内光强设置为0，25，50，100，200，400，600，800，1 000，1 500，1 800，2 000μmol/(m2·s)等12个梯度。

光响应曲线测定结果使用非直角双曲线模型按下式进行拟合[15]:

Pn(I)=

式中，Pn(I)为净光合速率；I为光强；α为初始斜率；θ为曲线曲率；Pnmax为净光合速率最大值；Rd为植株的暗呼吸速率。

1.2.6叶绿素含量的测定

参照高俊凤等[16]的测定方法并进行部分改动。选取所测样本植株相同部位的叶片剪成1 mm左右叶丝，称取叶片0.1 g放置于离心管中，加入体积比为1∶1的丙酮和乙醇混合溶液6 mL，黑暗条件下放置48 h，期间不时摇动离心管直至叶片变白。利用BECKMAN DU 640型分光光度计测定浸提液在470，645 nm和663 nm波长处的吸光值，3次重复。依据Arnon公式[17]计算光合色素浓度。

1.2.7统计分析

分别使用 Microsoft Excel软件和SPSS软件进行原始数据的处理和显著性分析。

2　结果与分析

2.1　植物表达载体图谱及PCR鉴定

对pSH-35 S-QPT和pSH-35 S-QPTi重组质粒载体进行PCR验证(图2)。分别扩增得到大小为750 bp和500 bp左右的特异性目的条带，表明目的基因和干涉元件已成功连接到重组质粒上。之后分别将重组质粒导入农杆菌LBA 4404，筛选阳性菌落用于后续的烟草遗传转化。

注：M为DL 2000 maker；C为pSH 737载体PCR鉴定；1为pSH-35 S-QPT载体PCR鉴定；2为pSH-35 S-QPTi载体PCR鉴定；N为阴性对照。图2　植物表达载体pSH-35 S-QPT和pSH-35 S-QPTi 的PCR鉴定

2.2　转基因植株的获得与鉴定

通过农杆菌介导的共转化法分别将含有pSH-35 S-QPT和pSH-35 S-QPTi的农杆菌菌液对烟草叶片进行侵染。经过共培养(图3 A)和筛选培养(图3 B)得到愈伤组织(图3 C)之后，诱导产生抗性芽(图3 D)，将抗性芽转入生根培养基进行生根培养(图3 E)，最后将获得的抗性植株移栽至含有营养土的花盆中生长(图3 F)。分别提取野生型和转基因烟草的基因组DNA，以QPT基因及其干涉片段的特异性引物分别进行PCR扩增，在转化株系中分别扩增出750 bp和500 bp左右大小的特异性目的条带(图4 B和图4 D)。经鉴定，最终分别获得32株超量表达QPT基因烟草和31株干涉表达QPT基因烟草。

注：A、B为转35 S-QPT基因烟草GUS组织化学染色和PCR鉴定；C、D为转35 S∷QPTi基因烟草GUS组织化学染色和PCR鉴定；M为DL 5000 Maker；P为阳性对照；1～5阳性植株；N为阴性对照。图4　转基因烟草的鉴定

注：A～C分别为移栽20，40 d与60 d的烟草植株。图5　转基因与野生型烟草生长状况比较

2.3　QPT基因对烟草形态的影响

分别对移栽后3个时期：团颗期(移栽20 d)，旺长期(40 d)和成熟期(60 d)的转基因烟草及同批繁殖的野生型进行株高，茎围，叶片数，叶长，叶宽和叶面积等形态性状测定(表1、表2和表3)。结果表明，不同生育期的超量表达QPT烟草和野生型烟草的各项形态性状指标差异未达到显著水平；但移栽20 d时，干涉表达QPT烟草的株高、茎围、叶片数和叶面积指标分别为14.26 cm、17.76 mm、13片和57.57 cm2，均显著低于野生型植株；移栽40 d时，干涉植株的株高、茎围、叶片数分别比野生型低31.77%、27.51%和30.47%，差异均达到极显著水平；移栽60 d时，干涉植株的株高、茎围、叶片数分别为野生型的71.69%、84.50%和78.63%，均显著低于野生型植株。同时，干涉烟草植株的花期出现推迟现象，其开花时间比超量表达QPT和野生型烟草晚10～15 d，推测QPT基因的干涉会影响烟草的生长发育及开花期的延迟。

表1转基因烟草和野生型移栽后20 d,40 d和60 d的农艺性状

时间(d)基因型　株高(cm)茎围(mm)　叶片数叶长(cm)叶宽(cm)叶面积(cm2)WT25.22±1.6128.48±2.3317.60±1.1417.06±0.4011.28±0.79122.25±11.3420QPT25.04±2.6728.17±2.3716.60±1.1417.28±1.3612.02±1.37132.58±24.42QPTi14.26±3.38∗∗17.76±0.64∗∗13.00±2.65∗∗11.94±1.16∗∗7.54±0.96∗∗57.57±12.03∗∗WT63.78±6.7937.00±1.1925.60±3.7821.28±0.8613.70±0.92185.28±19.0740QPT75.06±9.2442.42±4.0225.20±1.1023.96±2.4814.62±1.29222.26±30.33QPTi43.52±2.89∗∗26.82±2.31∗∗17.80±0.84∗∗22.36±0.6514.70±1.78208.74±27.55WT76.30±3.1339.28±0.7926.20±1.7922.58±0.9313.92±1.18199.79±23.3260QPT81.22±7.5742.36±5.4326.80±2.7723.28±1.1615.64±1.35231.55±28.59QPTi54.70±2.46∗∗33.19±1.88∗∗20.60±1.14∗∗23.14±1.4414.42±1.11211.42±16.11

注: N=5;p<0.01(**)。

图6　转基因烟草和野生型 Pn，Gs，Ci，Tr等光合特征指标的日变化

2.4　转基因和野生型烟草光合速率指标日变化规律

分别对转基因烟草及野生型光合特性指标的日均值进行分析。结果表明，超量表达QPT烟草与野生型在 Pn、Gs、Ci和Tr等指标间的差异均未达到显著水平，而干涉表达QPT烟草的Pn和Gs分别为10.59μmol/(m2·s)和0.266 mmol/(m2·s)，均显著低于野生型。从图5中可以看出，超量表达植株和野生型的Pn的日变化均呈双峰曲线，但是其峰值大小和出现时间各异。超量表达植株和野生型的第1个峰值均出现在12：00时，分别为19.89μmol/(m2·s)和18.95μmol/(m2·s)。超量表达植株的第二峰值出现在14：00时，为17.45μmol/(m2·s) ，比野生型早2 h。此外，两者的光合“午休”持续时间也有一定的差异，超量表达植株的Pn在13：00时出现下降，1 h后即开始回升，比野生型的午休持续时间短。而干涉植株的Pn的日变化呈单峰曲线，其Pn在13：00时达到峰值12.78μmol/(m2·s)之后，即呈现下降趋势。超表达QPT和野生型烟草的Gs在 12：00时均出现下降趋势，推测与午间的强光和高温导致的叶片气孔关闭现象有关[18]，但超表达植株在中午Gs的降幅要低于野生型。而QPT干涉烟草的峰值出现在13：00时和14：00时，随后呈下降趋势。

2.5　转基因与野生型烟草光响应曲线及光合特征比较

由图7可看出，当光强在500μmol/(m2·s)以内时，三者的光合速率皆随光强的增加而迅速增大；当光强大于500μmol/(m2·s)时，三者光合速率的增加皆趋于平缓，在达到各自的光饱和点(LCP)后接近稳定。为进一步研究植物的补偿光强和饱和光强，本研究以拟合曲线与直线y=Pnmax交点的x坐标为光饱和点(LSP);弱光下的线性方程(Pn≤200μmol/(m2·s))与x坐标轴交点的x坐标即为光补偿点(LCP)。

表2转基因烟草和野生型光合生理日均值比较

基因型净光合速率[μmol/(m2·s)]气孔导度[mmol/(m2·s)]胞间CO2浓度[μmol/(m2·s)]蒸腾速率[mmol/(m2·s)]WT14.94±2.890.360±0.06289.81±19.746.91±2.47QPT16.02±3.100.394±0.05284.75±7.148.34±2.65QPTi10.59±1.40∗∗0.266±0.06∗∗282.81±12.996.52±2.52

注:N=3;p<0.01(**)。

表3转基因烟草和野生型光合-光响应模型参数

基因型表观量子效率暗呼吸速率[μmol/(m2·s)]净光合速率最大值[μmol/(m2·s)]光补偿点[μmol/(m2·s)]光饱和点[μmol/(m2·s)]WT0.072±0.0163.564±1.36019.584±3.69165.864±21.3011432.408±50.296QPT0.073±0.0103.328±0.17121.082±1.43460.319±5.4521456.922±30.828QPTi0.088±0.0223.027±0.78911.699±2.055∗62.564±4.8701377.842±10.300

注:N=3;p<0.05(*)。

图8　转基因烟草和野生型叶绿素和类胡萝卜素含量

图7　转基因烟草和野生型拟合光合-光响应曲线

从表3可以看出，转基因烟草与野生型的最大净光合速率之间的差异达到了显著水平。其中转35S∷QPTi基因烟草分别比野生型和转35S∷QPT基因烟草低40.26%和44.51%，表明QPT基因干涉烟草对光合有效辐射的利用和适应能力较低。转基因烟草和野生型的表观量子效率与暗呼吸速率差异均未达到显著水平，说明三者的生理活性、光能利用效率并无显著差异。三者分别达到光补偿点的光照强度排序为QPT

2.6　转基因烟草叶绿素含量的测定

转基因烟草及其野生型叶片光合色素含量测定结果表明，超量表达QPT基因烟草的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别比野生型高5.68%，16.33%和12.8%，但是其差异均未达到显著水平。而干涉表达QPT基因烟草的叶绿素a含量比野生型低28.93%，类胡萝卜素含量比野生型低27.2%，均显著低于野生型。但其叶绿素b含量与野生型的差异未达到显著水平。转基因烟草叶片中光合色素含量的变化暗示，QPT基因的干涉可以影响烟草植株中叶绿素a、类胡萝卜素和总叶绿素的含量，进而影响植株的光合能力。

3　讨论与结论

近年的研究表明，QPT不仅参与烟碱的生物合成与调控，同时也是NAD从头合成途径中的关键酶[4]。而NAD作为生物体中能量代谢和呼吸代谢的电子受体，参与了细胞内的多种氧化还原反应[19]。由此可见，QPT在植物体的初生代谢和次生代谢中都扮演着重要角色[6,20]。同时，QPT通过吡啶核苷酸循环产生的多种重要衍生物如 NADP，NADPH，NAD和NADH等对于植物的正常生长发育至关重要[5,21]。

本研究以超量表达QPT和干涉表达QPT转基因烟草为材料，研究QPT基因对转基因植株形态特征，包括株高、茎围、叶片数和叶面积等影响。发现不同时期干涉烟草植株的株高、茎围、叶片数等重要农艺性状均显著低于野生型，其开花时间也出现了不同程度的延迟，说明QPT基因的干涉不仅影响烟草的正常生长发育，还可以调节转基因烟草植株的开花时间。Piquemal等[22]和Hashida等[23]的研究表明，烟草和拟南芥中吡啶核苷酸类衍生物含量的下降会使植株出现矮化和节间发育迟缓等异常表型。而在本研究中，通过RNAi技术介导的QPT基因沉默烟草植株也表现出了相似的性状，干涉植株的这种形态生理上的异常是否与其吡啶核苷酸类辅酶含量的变化有一定关系仍有待进一步的研究。另一方面，对其光合能力进行探究，发现干涉植株的Pn和Gs均显著低于野生型，这与Khan等[8]的研究结果一致。之后，测定转基因烟草的光响应曲线，发现干涉植株的最大净光合速率显著低于超量表达QPT基因烟草和野生型对照，说明干涉植株的C3碳反应活性以及电子传递效率明显低于野生型烟草[24]。相比于野生型，干涉烟草植株叶片的光合色素如叶绿素a、胡萝卜素和总叶绿素的含量也发生了明显的降低，但其叶绿素b含量未发生明显改变。考虑到光合作用是植物赖以维持生命及积累有机质的重要途径，而光合能力的水平是影响植物生长发育的重要因素[25]，推测干涉植株生长发育受到抑制的现象与其光合能力的下降有一定的相关性。计划下一步对T1代干涉植株的形态学指标进行观察和测定，同时研究其光合相关基因的表达。

本研究发现，烟草QPT基因的干涉表达可以导致转基因烟草植株出现矮化和花期延迟等现象，测定其光合特性及光合色素含量表明干涉植株的光合能力水平和光合色素含量皆出现显著下降，为阐明QPT在调节植物生长发育过程中的作用及定向培育烟草新种质提供一定参考。