甲基转移酶样3通过调控MYC的N6-甲基腺苷水平促进急性髓系白血病细胞的增殖

王小爽，何金蓉，于 姗，余 佳

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)由一系列发生在造血干细胞或祖细胞内的遗传学事件导致[1- 3]。尽管化疗对许多AML患者有效，但无效患者也很常见，而复发是治疗无效的最主要原因[3]。尽管人们对AML的发病机制已有一定了解，然而成年AML患者的总体生存率仍改善甚微[4]。2015年的一项研究显示，在使用常规化疗药物治疗时，只有35%～40%的年轻(≤60岁)和5%～15%的年长(>60岁)AML患者生存期能够超过5年[5]。因此，目前迫切需要深入了解AML发生发展的分子机制，从而为AML治疗开发出有效的靶向药物。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰是mRNA和lncRNA最主要的一种修饰，在真核生物中非常保守，从酵母、植物到高等动物中都广泛存在[6]。RNA甲基转移酶甲基转移酶样3(methyltransferase-like 3，METTL3)等可介导m6A的修饰，通过对特定RNA进行修饰，调控mRNA的生成、降解和翻译。本研究观察了METTL3在AML细胞增殖中的作用，初步探讨了其调控机制。

材料和方法

材料Western及IP细胞裂解液、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术公司)，Anti-rabbit-METTL3抗体(英国Abcam公司)，抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Magna MeRIP m6A kit(美国Millipore公司)，Lipofectamine LTX转染试剂、M-MLV逆转录酶、细胞培养基RPMI- 1640和IMDM、进口胎牛血清(美国Thermo-Fisher公司)，RT-qPCR试剂(中国大连Takara公司)；构建质粒所需的内切酶(美国NEB公司)，细胞增殖(cell counting kit- 8，CCK- 8)试剂盒[东仁化学科技(上海)有限公司]，PolyATtract®mRNA Isolation System(美国Promega公司)，RNA片段化试剂(美国Ambion公司)，Agilent RNA 6000 Nano Kit(美国Agilent公司)，EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit(美国Epigentek公司)，mRNA富集试剂盒PolyATract mRNA Isolation Systems(美国Promega公司)。

细胞培养MOLM13细胞购自美国ATCC细胞库，悬于 RPMI1640完全培养基(10%胎牛血清)中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。

基因表达汇编数据分析从https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds网站下载3个基因表达汇编(Gene Expression Omnibus，GEO)数据。同一个实验室来源的数据GEO30285和GEO34184，以及另一个实验室来源的数据GEO12803。3个数据均为芯片分析结果，用以进行METTL3相对表达量分析。

慢病毒制备和细胞感染采用Lipofectamine LTX转染293T细胞，48 h后收集培养上清。0.45 μm微孔滤膜过滤，20 000 r/min(r=17.3 cm)、4℃离心2.5 h，进行病毒颗粒的收集。弃上清，使用下游感染所需细胞培养基重悬病毒颗粒并分装，冻存于-80 ℃。慢病毒感染当天，将MOLM13细胞铺入六孔板。将病毒液加入细胞中，然后加入polybrene。细胞孵育过夜，感染12～16 h后更换新鲜完全培养基。感染48 h后加入嘌呤霉素(终浓度为1 μg/μl)筛选，筛选72 h得到稳转细胞系。

m6ARNA免疫共沉淀参照Dominissini 等[7]的方法，具体如下：TRIZOl法提取细胞总RNA，PolyATtract®mRNA Isolation System试剂盒富集得到多聚腺苷酸阳性(poly A+)的RNA，RNA fragmentation Reagents对RNA进行随机片段化，之后采用Agilent 公司的Lab-on-CHIP方法对片段化后的RNA大小和质量进行检测。合格的RNA使用Magna MeRIP m6A kit中m6A抗体进行免疫共沉淀，同型IgG作为阴性对照。沉淀之后的RNA继续用Lab-on-CHIP方法检测大小和质量。

Lab-on-CHIP检测RNA质量

胶制备：将试剂盒从冷藏室内取出，避光置于室温环境下至少30 min。从试剂盒中取出High Sensitivity DNA dye concentrate，将其涡旋混匀10 s，使其中的DMSO充分混匀。稍微离心使液体进入管底。取15 μl High Sensitivity DNA dye concentrate加入到High Sensitivity DNA gel Matrix vial，稍微涡旋混匀，混合好的液体加入到过滤柱中。将柱子放置于室温离心机中，2240 g离心10 min。将离心柱丢弃，保存离心后的试剂。

芯片制备：将胶混合液及试剂盒内试剂室温平衡30 min后，取出新的芯片，将芯片固定于芯片槽内，在注胶位置上加入9 μl，防止产生气泡。将注胶器上的注射器位置放于1 ml处，盖上注胶器，将注射器缓慢推下，固定在最低档后开始倒计时60 s。取下注射器，默数5 s后，缓慢将注射器上提，至1 ml处时停止。打开芯片制备器，在加胶孔各加入9 μl混合胶。加入Marker和ladder，之后在样本孔中加入1 μl样本(样本浓度范围为5～500 pg/μl)。将制备好的芯片置于芯片混匀仪中，在最大转速1 min，在5 min内将芯片进行测定。

实时荧光定量PCRTRIZOl法提取细胞总RNA。测定RNA样品的浓度和纯度，A260/A280值在1.80～2.00间。M-MLV 合成 cDNA 第1链。采用GAPDH为相对定量的内参基因，每个样品实验设计3个复孔，检测总体积为20 μl，具体如下：94℃ 10 s；58℃ 10 s，72℃ 20 s，50个循环；94℃ 15 s，64～94℃，缓慢升温，产生溶解解离曲线。RT-qPCR所用引物见表1，MeRIP之后RT-qPCR所用到的阳性和阴性引物为Magna MeRIP m6A kit试剂盒提供，MYC的引物见参考文献[8]。

shRNA载体的构建通过shRNA干扰片段在线设计(网站http：//rnaidesigner. Thermosfisher.com/rnaiexpress/)软件设计METTL3的干扰序列，设计3条shRNA，并在shRNA两端连接相应的酶切位点黏性末端。序列送天一辉远生物技术有限公司合成。合成的片段退火，退火得到的片段与PLKO.1载体连接。

Westernblot检测收集细胞并采用Western及IP细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白样品，每个样品上样量为20 μg。随后将蛋白转印到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入Anti-rabbit-METTL3一抗孵育过夜，随后加入抗兔二抗，室温孵育1 h。DAB法显影，分析蛋白表达。

表 1 RT-qPCR扩增引物序列Table 1 Primers for RT-qPCR

CCK-8法检测细胞增殖在96孔板中配置100 μl的细胞悬液，每孔细胞数量为3000～5000个。将培养板在培养箱预培养24 h(37℃/5% CO2)。向培养板加入10 μl CCK8，在培养箱孵育4 h，不要在孔中生成气泡。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

RNAm6A水平检测TRIZOl法提取细胞总RNA。按照说明书，采用PolyATract mRNA Isolation Systems富集polyA+mRNA。根据ELISA的原理，利用EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit测定m6A水平，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。试剂盒中自带阳性对照(PC)和阴性对照(NC)。m6A的计算公式如下：%m6A=[(样品OD-NC OD)/ng RNA]/[(PC OD-NC OD)/ng PC]。

统计学处理采用Prism 5.0统计软件[9]，实验数据均以均数±标准误表示，组间均数比较采用非配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

METTL3在M5型AML患者中有上调趋势GEO数据分析显示，与正常对照相比，METTL3的表达仅在M5型AML患者的骨髓细胞中有上调趋势。幼稚细胞中的METTL3相对表达量(相对CD34细胞)显著高于成熟的单核细胞(t=4.504，P=0.0098，n=3)(图1)。

抑制内源METTL3表达可减缓AML细胞增殖选取M5型AML来源MOLM13细胞系，采用2条位点特异的shRNA敲低内源METTL3后，均成功在RNA和蛋白水平抑制METTL3的表达(t=11.05或12.25，P<0.0001，n=3)，其中3号shRNA(sh3)的抑制效果在蛋白水平更显著。使用2个shRNA抑制METTL3的表达均可导致MOLM13细胞增殖受阻(t=11.91或8.991，P<0.001，n=3)(图2)。

敲低METTL3表达可减低mRNA的m6A水平2个稳定敲低METTL3表达的细胞中，总mRNA的m6A水平均有所下降，但是只有sh3对m6A的改变有统计学意义(t=3.606，P=0.042，n=3)(图3)。

MeRIP后RNA的质控采用MeRIP检测METTL3敲低对MYC m6A水平的影响，结果显示，poly A+RNA中核糖体RNA已经全部去除(没有18 s和28 s rRNA的峰)，随机片段化后的RNA大小集中在25～200 bp的区域；利用m6A抗体进行免疫共沉淀后富集的RNA多于IgG。RNA质控合格(图4)。

METTL3调控MYC上的m6A修饰水平在MOLM13细胞中进行MYC特异的MeRIP，对结果采用%Input和相对IgG的富集倍数两种方法分析，结果均显示METTL3的表达抑制(M3_sh3)能够显著降低阳性对照mRNA的富集(t=6.301，P=0.0053，n=3；t=3.072，P=0.037，n=3)。同时，m6A抗体对MYC的富集也在METTL3表达抑制后显著降低(t=6.633，P=0.0026，n=3；t=4.609，P=0.010，n=3)(图5)。

METTL3调控MYC的表达在成功抑制MOLM13细胞中METLL3表达的前提下，MYC的表达在RNA和蛋白水平上均显著下降(t=5.354，P=0.0058，n=3)(图6)。

METTL3：甲基转移酶样3；AML：急性髓系白血病；aP<0.01；bP<0.0001

METTL3：methyltransferase-like 3；AML：acute myeloid leukemia；aP<0.01；bP<0.0001

A.METTL3在不同类型AML中的表达变化；B.METTL3在造血干细胞、祖细胞和成熟髓系细胞中的表达

A. relative expressions of METTL3 in multiple AML types；B. relative expressions of METTL3 in CD34 hematopoietic stem cells，progenitors，and mature myeloid cells

图1METTL3的表达变化

Fig1Expressions of METTL3

aP<0.001；bP<0.0001

A. 内源METTL3抑制后METTL3 mRNA表达水平；B. 内源METTL3抑制后METTL3蛋白表达水平；C. 内源METTL3抑制(M3_sh2和M3_sh3)后减缓细胞增殖

A. expression of METTL3 mRNA after endogenous METTL3 knock-down；B. expression of METTL3 protein after endogenous METTL3 knock-down；C. inhibition of endogenous METTL3 suppressed cell proliferation

图2内源METTL3抑制对AML细胞增殖的影响

Fig2Effect of endogenous METTL3 inhibition on AML cell proliferation

m6A：N6-甲基腺苷；aP<0.05

m6A：N6-methyladenosine；aP<0.05

图3METTL3抑制降低总mRNA的m6A水平

Fig3METTL3 inhibition decreased m6A level in total mRNA

讨 论

在成体中，造血分化是一个由造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)逐步分化为成熟血液细胞的过程，受到严格调控[10]。其中，髓系生成或成髓是指HSC向髓系前体细胞以及成熟髓系细胞分化的过程，这一过程受到多重调控，包括转录调控、转录后调控以及翻译调控[11]。在转录水平，转录因子(例如PU.1和C/EBPα等)与一系列信号转导途径整合，共同调控mRNA的表达水平[12- 13]。在转录后水平，miRNA与lncRNA通过与mRNA的直接或间接结合，调控mRNA的转录水平[14- 15]。髓系生成的调控异常可导致一系列疾病的产生，包括AML。AML是一种克隆性造血异常，具有干细胞样的自我更新能力而分化受阻[16]。AML-M5患者的主要表现是单核细胞分化受阻，不能产生成熟的单核细胞[17]。

图4Lab-on-CHIP检测MeRIP后RNA的质量

Fig4RNA quality after MeRIP (by Lab-on-CHIP)

aP<0.05；bP<0.01

图5MeRIP发现METTL3抑制降低了MYC特异性m6A水平

Fig5MYC-specific m6A level was decreased after METTL3 inhibition by MeRIP

aP<0.01

图6METTL3抑制降低了MYC表达水平

Fig6METTL3 inhibition down-regulated MYC expression

近来研究进一步揭示了转录后调控的复杂性：一方面RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)能够通过与RNA结合在多种细胞过程中发挥作用，包括转录、RNA剪切和加工、定位、RNA稳定性以及翻译等[18]；另一方面，已知RNA上存在超过100种修饰，用以调节RNA的稳定性和翻译，其中mRNA内部最常见的有m6A、N1-甲基腺苷、5-甲基胞嘧啶等修饰[9]。

在哺乳动物中，发生m6A修饰的腺苷酸占细胞内所有mRNA腺苷酸的0.1%～0.4%左右。虽然m6A修饰早在40多年前就已经被发现，但对其产生机制、在转录组中的分布以及修饰对基因表达调控的影响一直缺乏了解[19]。直到MeRIP-seq实验方法的建立，才使研究者有机会对该修饰的分布、功能进行深入研究[20]。近5年来，对m6A的研究已成为热点，研究集中在全转录组水平上的修饰位点检测，以及m6A与疾病的关系等方面。

m6A修饰是动态可逆的，METTL3是最早发现的能够进行m6A修饰的甲基转移酶[21]。尽管自身对含有“GGACU”保守序列的RNA底物具有催化活性，在体内METTL3与另一个催化酶METTL14及辅助蛋白WTAP形成复合物发挥作用[22]。m6A修饰对mRNA的影响主要依靠m6A的阅读器来实现。在胞质中，YTHDF1和YTHDF3最主要的功能是促进mRNA的翻译；而YTHDF2最主要功能是调控mRNA的稳定性，加速mRNA的降解。此外，m6A修饰还可以改变RNA的二级结构、调控microRNA的靶标识别来调控mRNA的稳定性。在核内，m6A修饰可以调控RNA的剪接、出核过程，从而调控基因表达[23]。

本研究中我们关注了在AML发展过程中METTL3的功能及其作用机制。首先发现METTL3在AML-M5患者中有上调趋势，并且其表达在髓系前体细胞中显著高于成熟单核细胞，提示METTL3在急性单核细胞白血病中可能发挥原癌基因的功能。功能研究发现METTL3有促进MOLM13 AML细胞增殖的作用。随后的机制探索发现，METTL3可以增加MYC mRNA上m6A的水平，从而促进MYC蛋白的表达。MYC是著名的原癌性转录因子，通过抑制分化来促进AML细胞的自我更新而在AML发展中发挥作用[24]。后续的研究将进一步找到参与识别MYC上m6A的阅读器蛋白，从而发现METTL3对MYC调控的完整通路。

综上，本研究结果发现，介导m6A修饰的METTL3蛋白在M5型AML细胞中具有促进增殖的作用，并且AML发生中关键的原癌基因MYC是METTL3的调控靶点。本研究进一步揭示了M5型AML的发生机制，并为该病的治疗提供新的靶点。

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