脱水方式对无核白葡萄酚类代谢及品质的影响
2018-07-09肖超男白羽嘉章思博古力尼格尔玉散江黄文书
肖超男,白羽嘉,陈 雪,章思博,古力尼格尔·玉散江,黄文书,2
(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆农业大学园艺学博士后流动站,乌鲁木齐 830052)
0 引 言
【研究意义】中国是世界上最大的绿色葡萄干生产国,新疆吐鲁番地区是中国葡萄干主要产地,其特色产品为无核白葡萄阴干的绿葡萄干。据统计,2012年葡萄产量占新疆水果产量的28.7%[1]。由于葡萄成熟期比较集中,采后脱水干制是葡萄加工的一个重要方式。无核白葡萄(VitisviniferaL.varWuhebai)是生产绿葡萄干的主要品种。传统晾房生产的无核白葡萄干褐变现象极其普遍,已成为制约新疆葡萄干产业持续健康发展的关键性问题,因此,无核白葡萄采后脱水干制褐变机理的研究显得尤为重要。多数研究认为葡萄干褐变的原因是无核白葡萄皮或葡萄果肉中的酚类物质在多酚氧化酶(PPO)的作用下,被氧化变成醌及其聚合物并反应发生褐色素或黑色素造成褐变的现象[2]。酚类物质是葡萄果实中重要的次生代谢产物,与葡萄采后运输、贮存、保鲜等品质指标密切相关。因此,酚类物质研究一直是葡萄采前、采后研究的重要热点之一。苯丙烷类代谢途径是植物次生物质代谢的一条重要途径,与酚酸、类黄酮等酚类物质和木质素、羟基肉桂酸酯等许多次生代谢物的合成有关。研究表明,苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H),4-香豆酸酰辅酶连接酶(4CL)是苯丙烷类代谢途径的三个关键酶[3-4]。【前人研究进展】由刘峰娟[5]研究发现,缓慢脱水和快速脱水处理的无核白葡萄在质量损失皆为50%时出现明显褐变现象,并在其蛋白质组学的研究中揭示葡萄果实褐变与无核白葡萄干制过程中次生代谢产物类黄酮和酚类含量及代谢的变化有关。烘箱干燥是一种便捷、经济、易于推行的机械干燥方法。在干燥物料时通常使用热风循环烘箱,热风在热风循环烘箱箱内循环,热效率高,节约能源,烘箱内设有可调式分风板,物料干燥均匀,且适用范围广,可干燥各种物料,具有投资低、管理方便等优点,是一种通用的干燥设备[6-9]。用烘箱干燥果蔬已有大量报道,张利娟等[10]研究了热风干燥对无核白葡萄总酚和抗氧化性的变化,张英丽等[11]研究了无核白葡萄经过热风干燥后的品质。徐飞等[12]对菠萝蜜的研究结果表明,抗坏血酸随着温度升高,含量在降低;李焕荣等[13]对红枣热风干燥进行了研究,发现采用相对较低的干制温度,能最大限度地减少营养成分的损失。孟阳等[14]分别在30、35、40和45 ℃ 条件下进行热风干燥,得出在干燥无核白葡萄过程中,葡萄中的抗坏血酸、可滴定酸、总酚含量下降,而褐变度上升。 【本研究切入点】研究不同脱水干制方式对无核白葡萄干制过程中酚类代谢及品质特性的影响。【拟解决的关键问题】以富含酚类物质的无核白葡萄果实为材料,检测两种不同干制方式对无核白葡萄干制过程中酚类、总类黄酮、苯丙烷类代谢酶系(包括PAL、C4H、4CL)的指标。为阐明苯丙烷类代谢物质变化及无核白葡萄酚类类黄酮等物质合成中的生理功能提供依据,为提高无核白葡萄干的品质提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 无核白葡萄
购于北园春水果市场,挑选成熟度一致、健康、无病虫害及腐烂果,果实色泽碧绿,果穗及颗粒大小均匀(直径为9.4 mm±1.12 mm;长度为14.00 mm±1.14 mm),可溶性固形物质量分数为20%±2.5%,含水率为80%±0.82%的果实为试验材料进行以下处理。将挑选好的试验样品随机均匀分成两组:快速脱水工艺条件:将修剪大小一致葡萄串平放于热泵干燥箱中的托盘里,热风处理温度40℃,相对湿度<20%;缓慢脱水工艺条件:将葡萄置于搭制的晾架上自然脱水,环境平均温度为25℃,平均相对湿度45%。随时计算葡萄的质量损失,当葡萄脱水质量损失率达到60%时结束取样,在此过程中分别在葡萄质量损失率为10%、20%、30%、40%、50%和60%时取样,测定各项指标,每个处理重复3次。
1.1.2 仪器与试剂
紫外—可见分光光度计:TU-1810型,北京普析通用仪器有限责任公司;
高速冷冻离心机:TGL-16G型,上海安亭科学仪器厂;
冰箱:DW-FL90-40℃,(中科美菱);
超声波清洗器:SK2200H型,上海科导超声仪器有限公司;
电子天平:FA2104N型,上海民桥精密科学仪器有限公司;
电热恒温恒湿干燥箱:CS101型,乌鲁木齐电器设备制造厂;
氢氧化钠:分析纯,天津市光复科技发展有限公司;
甲醇:分析纯,天津市福晨化学试剂厂;
福林肖卡:优级纯,北京索莱宝科技有限公司。
1.2 方 法
1.2.1 测定指标
1.2.1.1 褐变度
1)公交刷卡乘客上车站点识别包含2个模型,基于IC卡刷卡时间识别(模型2)相较于基于GPS时间识别(模型1)存在明显缺陷,部分站点缺乏刷卡数据或部分乘客刷卡时公交车辆已经驶离站点,这些缺陷会导致下车站点无法识别或识别错误. 并且利用实际数据试算时发现采用模型2识别,站点序号基本对应不上,而模型1站点识别率高达98.31%,所以最终选取模型1为识别模型.
称取2.0 g(以干质量计)冷冻的无核白葡萄果实,在液氮条件下研磨粉碎,加入10倍的蒸馏水,旋涡匀浆后,在4℃条件下8 000×g离心25 min,取离心后得到的上清液在波长为420 nm处测定其吸光度值,褐变度以A420表示,空白对照为蒸馏水[15]。
1.2.1.2 总酚
总酚采用福林肖卡试剂法[15]测定,以μg/g表示。酚标准溶液(5 mg/g)配制:称取0.500 g没食子酸,先用10 mL乙醇溶解,再用蒸馏水定容至100 mL。标准曲线的制作:用微量移液器从0、50、75、100、125、150、250和500 mg/L的系列没食子酸标准溶液中吸取250 μL分别加入25 mL比色管,加蒸馏水12.5 mL,混合摇匀,加入福林肖卡显色剂1.25 mL,20%碳酸钠溶液3.75 mL,加蒸馏水定容至刻度,摇匀。显色反应2 h后在765 nm波长下测定系列标准溶液的吸光度A,绘制标准曲线。
1.2.1.3 总黄酮
采用亚硝酸钠与硝酸铝显色法[16]测定,以μg/g表示。标准曲线的制作:精确称取置于120℃下干燥至恒重的芦丁5.00 mg,用50%乙醇溶液溶解并定容至50 mL,震荡摇匀。用移液枪分别吸取芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL比色管中,分别加入5 mL 50%乙醇溶液,加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液摇匀,静置6 min后加入0.3 mL 5%硝酸铝溶液摇匀,静置6 min后加入4 mL 4%氢氧化钠溶液,并用50%乙醇定容至刻度,摇匀,静置12 min后放置于504 nm处测吸光值A,绘制标准曲线。
1.2.1.4 PAL酶活性
参照曹建康[17]的方法并修改。取3 g冷冻果肉组织,加入3 mL pH 8.0、0.1 mo1/L的硼酸缓冲液(内含10% (w/v) PVPP,1 mmol/L EDTA和50 mmol/L β-巯基乙醇)用液氮充分研磨,然后于4 ℃,8 000×g条件下离心30 min,收集上清液并立即用于酶活性测定。反应体系为:取1 mL pH 8.0,0.02 mol/L L-型苯丙氨酸溶液用硼酸缓冲液配制,6 mL pH 8.0,50 mmol/L 硼酸缓冲液,先将反应液于30℃水浴反应10 min,然后加入 1 mL粗酶液,在290 nm处测定吸光度值,空白加1 mL蒸馏水,不加酶液,其余同反应体系。酶活性以每小时每克鲜重果蔬组织反应吸光度增加0.01时为1个PAL活性单位(U),活性以U/h/g/FW表示。样品重复测3次。
1.2.1.5 肉桂酸羟化酶(C4H)活性
1.2.1.6 4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)活性
粗酶液制备:取2 g冷冻果肉,加入4 mL 0.2 mol/L Tris-HCl 缓冲液(50 mmol / L pH 8.9 Tris-HCl 缓冲液,15 mmol/Lβ-巯基乙醇,5 mmol/L EDTA,5 mmol/L VC,10 μmol /L 亮抑酶肤,1 mmol/L PMSF,0.15%( w/v ) PVP,30%甘油),混匀后,超声破碎2 min,然后于4℃,8 000×g条件下离心30 min,收集上清液即为4CL粗酶提取液,并立即用于酶活测定。反应体系:1.8 mL 15 μmol/L(硫酸镁或氯化镁)Mg2+,0.6 mL μmol/mL p-香豆酸,0.6 mL 50 μmol/mL ATP,0.6 mL μmol/mL CoA以及2 mL酶液于40℃下反应10 min,在333 nm处测定吸光度值,以1 min内OD值变化0.1为1个活性单位(U)。酶活性单位为U/min/g/FW,对照不加香豆酸。样品重复测3次。
1.3 数据处理
采用DPS数据处理系统软件对试验数据进行单因素方差分析和相关性分析,Origin 9.0软件绘图。邓肯氏多重差异比较,当P<0.05 时,表示差异显著,当P<0.01时,表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 不同干制处理对无核白葡萄褐变度的影响
研究表明,在两种不同干制方式脱水处理下的无核白葡萄,其褐变度呈现上升的趋势。在无核白葡萄质量损失为30%之前,其褐变度上升趋势较为缓慢。自然阴干处理的无核白葡萄在质量损失为30%后褐变度上升速度加快,而此时无核白葡萄已经开始出现较为显著的褐变现象。之后褐变度随着脱水的进行而进一步的升高。在质量损失为60%时,无核白葡萄的褐变度由最初的0.05增大到结束取样时的1.15,增大了23倍。在质量损失为40%时,热风干制处理的无核白葡萄较自然阴干处理褐变明显,之后褐变现象发展迅速,当质量损失为60%结束取样时,褐变度为1.03,是自然阴干脱水处理的89.50%(P<0.01)。无核白葡萄在自然阴干脱水处理下褐变度显著高于热风干制脱水处理(P<0.05),说明无核白葡萄在热风干制脱水处理下可以有效减缓其褐变的发生。图1
2.2 不同干制处理对无核白葡萄总酚含量影响
研究表明,自然荫干和烘箱干制两种干制处理方式随着质量损失率的增加,均对总酚含量呈现明显的降低趋势,这与刘峰娟[5]、张利娟[10]等对热风干制处理无核白葡萄的研究结果一致,多酚含量呈整体下降的趋势。果实的酶促褐变底物为酚类物质,因此,酚类物质与褐变关系十分密切,在刘峰娟[5]的研究中,无核白葡萄干制过程中褐变度也呈上升趋势,与研究的总酚含量变化研究结果一致。当质量损失率为50% 时,此时两种干制的总酚含量相同,其中方差分析可得,在质量损失率为60%之内时对总酚含量的影响极为显著(P<0.01)。 图2
图1 不同干制处理对无核白葡萄褐变度影响
Fig.1 Effect of different drying treatments on browning degree of white grape seedless
图2 不同干制处理下无核白葡萄总酚含量变化
Fig.2 Effect of different dry treatments on total phenolic content of seedless white grape
2.3 不同干制处理对无核白葡萄黄酮含量影响
研究表明,自然荫干和烘箱干制两种干制处理方式随着质量损失率的增加均可降低总黄酮的含量。其中,烘箱干制在失水率为40%之内时持续下降,之后失水率缓慢降至到60%,由最初的总黄酮含量持续降至7.88 μg/g,低于对照组,而葡萄果实发生褐变即在质量损失为50%时,烘箱干燥时的总黄酮含量低于对照组。由方差分析可知,在质量损失率为60% 之内时对总酮含量的影响较为显著(P<0.01)。图3
图3 不同干制处理下无核白葡萄黄酮含量变化
Fig.3 Effect of different dry treatments on flavonoid content of seedless Grapevine
2.4 不同干制处理对无核白葡萄果实PAL活性的影响
研究表明,自然荫干和烘箱干制两种干制脱水方式对PAL活性有一定的作用,在质量损失率0~20%时,PAL的活性呈现降低的趋势,其中,烘箱干制的PAL活性低于对照组;接着质量损失率在20%~40%,其活性又逐渐的增强,最后,在干燥率达到60%时,PAL的活性逐渐降低,说明在果实褐变时PAL的活性正处于逐渐降低的过程,在质量损失率为60%之内时 ,两种干制处理差异较显著(P<0.05)。图4
图4 不同干制处理下无核白葡萄果实PAL活性变化
Fig.4 Effects of different dry treatments on PAL activity in seedless white grape
2.5 不同干制处理对无核白葡萄果实C4H活性的影响
研究表明,自然荫干和烘箱干制两种干制处理方式对C4H酶活性的作用趋势一致,在整个质量损失的过程中,两种处理方式均能不同程度的增强C4H酶的活性。其中在质量损失率0~10%、20%~40%、50%~60%的阶段时C4H酶的活性呈上升趋势。反之,在质量损失率为10%~20%、40%~50%时C4H酶的活性呈下降趋势;其中在无核白葡萄质量损失率为50%时,烘箱干制处理下的酶活性出现最低点为0.38 U/h/g/FW,说明在葡萄果实褐变时C4H酶的活性较低为0.44 U/h/g/FW但高于对照组。随后在量损失率一直持续达到60%时,烘箱干制方式处理下的C4H酶活性一直升高。且在此过程中两种处理方式下的酶活性都增至最高。在质量损失率为60%之内时,两种干制处理差异显著(P<0.05)。图5
图5 不同干制处理下无核白葡萄果实
C4H活性变化
Fig.5 Effect of different dry treatments on
C4Hactivityofseedlesswhitegrape
2.6 不同干制处理对无核白葡萄果实4CL活性的影响
研究表明,自然荫干和烘箱干制两种干制处理方式对4CL酶活性的作用趋势一致,在整个质量损失的过程中,其中在质量损失率0~10%、30%~40%、50%~60%的阶段时4CL酶的活性呈上升趋势。反之,在质量损失率为10%~20%、40%~50%时4CL酶的活性呈下降趋势;而在此过程中自然荫干和烘箱干制处理下的酶活性分别达到最低点和最高点,其中在无核白葡萄质量损失率为20%时,自然荫干酶活性最低点为0.35 U/h/g/FW,而烘箱干制处理下的酶活性最低点为0.34 U/h/g/FW,低于对照组;随后在量损失率一直持续达到50%时即果实褐变时,两种干制方式处理下的4CL酶活性出现转折点呈降低趋势。图6
图6 不同干制处理下无核白葡萄果实4CL活性变化
Fig.6 Effects of different dry treatments on 4CL activity in seedless white grape
2.7 不同干制处理无核白葡萄总酚、黄酮变化与褐变度变化的相关性分析
研究表明,不同脱水方式处理无核白葡萄干制过程中总酚、黄酮含量变化与两种干制方式处理的褐变度变化的相关系数均在0.5以上,尤其总酚含量的变化与褐变度的相关性达到极显著水平,说明随着脱水过程中无核白葡萄褐变度的升高,酶促褐变的反应底物总酚和总黄酮含量呈现逐渐降低的趋势。表1
表1 总酚、黄酮含量变化与两种干制方式褐变度相关性
Table 1 Changes of Total Phenols and Flavonoids Content and Correlativity between Two Drying Methods Brown Degree
指标Index自然阴干干制处理褐变度Browning of slow drying treatment烘箱干制干制处理褐变度Browning of rapid drying treatment总酚-0.896**-0.864*总黄酮-0.772*-0.833*
注:**表示极显著,P<0.01;*表示显著,P<0.05
2.8 不同干制处理无核白葡萄PAL、C4H、4CL活性变化与酚类物质变化的相关性
研究表明,不同脱水方式处理'无核白'葡萄干制过程中PAL、C4H、4CL活性变化与酚类物质总酚和黄酮含量变化的相关系数均在0.5以上,尤其是4CL和C4H活性变化与酚类物质的相关性达到显著水平,表明在脱水过程中苯丙烷类代谢酶4CL和C4H与葡萄酚类物质的变化有较高的相关性。表2
表2 PAL、C4H、4CL活性变化与酚类物质含量变化相关性
注:**表示极显著,P<0.01;*表示显著,P<0.05
3 讨 论
无核白葡萄果实富含花色苷和多酚类等生物活性成分,具有非常强的自由基清除能力和抗氧化活性,且随着干制时间的延长,酚类物质含量及抗氧化活性呈降低趋势[5]。但无核白葡萄果实采后酚类物质含量与苯丙烷代谢的关系尚不清楚。前人研究表明,在苯丙烷类代谢过程的相关酶活性对于合成酚类物质有着重要的影响,随着苯丙烷代谢途径中关键酶PAL、C4H、4CL活性的升高,植物体内积累大量酚酸、类黄酮等酚类物质[20]。在无核白葡萄两种不同脱水方式干制处理过程中,对PAL、C4H、4CL活性与两种脱水方式处理的总酚和黄酮含量进行相关性分析发现,4CL和C4H活性变化与总酚和总黄酮类物质的相关性达到显著水平。表明PAL、C4H、4CL活性变化与无核白葡萄脱水干制过程中的酚类物质变化密切相关。但总酚、总黄酮含量的变化趋势与C4H和4CL活性的变化趋势正好相反。通过分析,也显示这两种酶的活性与葡萄总酚、总黄酮含量存在负相关关系,这与孙坤的研究结果类似,其主要原因可能是:苯丙烷类代谢的产物中除酚类化合物、黄酮类化合物外,还有其他包括木质素等次生代谢物质,而酚类物质、黄酮类化合物含量的高低不仅与相关酶活性有关外,还与次生代谢的中间产物酚类、木质素、类黄酮等化合物的分配有关。在脱水处理过程中,葡萄苯丙烷类代谢被激活,PAL、C4H和4CL活性升高,而总酚和总黄酮含量并没有提高,可能与更多中间代谢产物用于木质素等其他次生代谢产物的生物合成有关。也可能与酚类物质在PPO、POD催化下氧化、聚合,不断被消耗有关。
4 结 论
4.1 无核白葡萄脱水干制过程中,自然阴干和40℃热风干制两种方式处理无核白葡萄的褐变度与总酚、总黄酮含量都呈现显著的负相关关系(P<0.05)。
4.2 在脱水过程中,葡萄苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性呈现先增高再降低的趋势;而4-香豆酰-辅酶A连接酶(4-coumaryl-CoA ligase,4CL)和肉桂酸-4-羟化酶(Cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)的活性总体呈持续上升趋势。在脱水前期,自然阴干葡萄PAL活性显著高于热风干制葡萄。在脱水前期热风干制葡萄C4H活性低于自然阴干葡萄,但质量损失超过30%后,热风干制葡萄C4H活性显著高于自然阴干葡萄(P<0.05)。葡萄4CL酶活性在整个脱水过程中两种处理间都无显著差异。苯丙烷代谢关键酶C4H、4CL活性变化与无核白葡萄脱水干制过程中的总酚、总黄酮类呈负相关的关系。
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