新型高效毛细管电泳整体柱拆分拉米夫定

章冰娜，沈静茹，舒亚玲，张 思

(中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室，湖北 武汉 430074)

与传统的高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)等色谱技术相比，HPCE由于其分离效率高、溶剂和手性选择剂用量少和分析时间短等优势获得了越来越快的发展和应用[1]。近年来，CE在药物分析中具有较高的应用潜力[2]。拉米夫定是临床应用中治疗效果较好、较具代表性的核苷类抗病毒药物之一。该药有效抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶的活性，同时对病毒DNA链的合成和延长有竞争性抑制作用。目前多应用于抗乙型肝炎病毒(HBV)和抗艾滋病毒(HIV)的治疗[3]。但拉米夫定的右旋体细胞毒性较强，对人体线粒体DNA合成存在抑制作用，会引发周围神经病变[4]。目前拉米夫定对映异构体的分离一般以HPLC和GC为主要方式，可实现对单一对映体的含量测定。Nagasarapu[5]等在反相高效液相色谱(RP-HPLC)上用梯度淋洗模式，进行拉米夫定分散片中活性药物的含量检测，在流动相为0.05 mmol/L磷酸缓冲液pH值6.2，有机添加剂为乙腈的条件下，拉米夫定平均保留时间为2.8min，峰面积分离度Rs达0.66。

本文采用双[-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1,4-单酯-4-)-]-β-CD(β-CD-F2)手性选择剂制备新型HPCE手性整体柱，对拉米夫定外消旋体混合物实现手性拆分，并对拆分条件进行优化。最佳条件下，拉米夫定外消旋体混合物分离度可达22.02。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

拉米夫定对映体混合物(中国食品药品检定研究院)，三羟甲基氨基甲烷(Tris，超高纯，陶氏化学公司子公司)，磷酸(分析纯，天津市科米欧化学试剂有限公司)，超纯水、双[6-氧-(3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1,4-单酯-4-)]-β-环糊精(自制)。高效毛细管电泳仪(P/ACE MDQ，美国BECKMAN公司)，酸度计(pHs-3c型，上海伟业仪器厂)，熔融石英毛细管(河北省永年光纤厂)，电子分析天平(FA2004型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.2 电泳条件

β-CD-F2整体柱为固定相，Tris-H3PO4缓冲液为流动相，所有溶液经过0.22μm微孔滤膜过滤。HPCE仪每次运行前,保证在环境湿度在60%以下，室温20℃。先用过滤后的缓冲液顶洗整体柱10min，再加电场洗涤40min左右，重复上述操作过程，直到基线平稳。然后放入拉米夫定样品在一定条件下自动进样进行分析处理。

2 结果与讨论

2.1 缓冲液pH值的变化对分离情况的影响

在β-CD-F2手性整体柱上，检测波长270nm，工作电压18KV，Tris-缓冲液浓度为50mmol/L，拉米夫定对映体混合物浓度2.69×10-3mol/L，室温20℃，进样时间5s，进样压力0.8psi条件下，改变缓冲液pH值为3.7、4.2、4.7、5.2、5.7时，分离度Rs分别为0、3.75、2.73、8.69和5.72. 缓冲溶液的酸碱度可以有效调整电迁移和电渗的平衡，从而达到增大目标物分离度的目的[6]。在β-CD-F2整体柱上，酸性条件下，Tris-磷酸缓冲液pH值的变化对拉米夫定对映体混合物的响应信号、峰形及分离度在pH值4.2～5.7范围内有明显的影响，存在一个最佳pH值，此时手性物质的两对映体与β-CD-F2形成配合物的络合平衡作用相差最大。综合考虑，选择pH值5.2为拉米夫定外消旋体拆分在此体系中的最佳分离pH值。

2.2 进样量的变化对拆分拉米夫定对映体混合物的影响

在2.1条件下，选择缓冲溶液pH值为5.2，分别进样2.69×10-3mol/L、0.8psi和5.38×10-4mol/L、0.5psi的拉米夫定对映体混合物，确定后者较为合适，在此条件下，继续改变进样时间分别为3、5、8、10、12s，探究进样量对拆分拉米夫定对映体混合物的影响，分离结果显示最适进样时间为5s。

2.3 工作电压的变化对拆分拉米夫定对映体混合物的影响

在2.2的分析条件下，改变工作电压分别为13、15、18、20、23kV。实验结果如图1所示。

图1 工作电压对拉米夫定对映体混合物分离的影响HPCE图

Fig.1 Effect of voltage on the separation of lamivudine enantiomer

改变工作电压对电迁移和电渗流有一定的影响，增加工作电压有利于加快分离速度。拉米夫定两对映体的保留时间随着电压的增大而减小，样品得以更快的速度洗脱。而两对映体的洗脱强度和分离度都呈现出一种先上升后下降的趋势，且20kV时两峰分离度高达20.02。大于20kV则可能由于电场强度增大，电渗速度加快，使样品的迁移速度过大导致β-CD-F2与样品的作用时间缩短从而选择性降低，或由于焦耳热过高，使拆分结果变差。综合考虑，选择20kV为当前体系中拉米夫定外消旋体拆分的最佳电压。

2.4 Tris-磷酸缓冲液浓度变化对拆分拉米夫定对映体混合物的影响

在2.3的分析条件下，改变Tris-磷酸缓冲液浓度，分别为30、40、50、60、70 mmol/L。实验结果表明，合适的缓冲液浓度对分离的选择性和分离效率均有较大的影响，过高的缓冲液浓度可能导致焦耳热增加影响分离[7]。结合表3数据分析可知，随着缓冲液浓度的增加，拉米夫定两对映体的保留时间、前峰的洗脱强度均变化不大，然而保留值和后峰的洗脱强度在50 mmol/L与其他浓度相比有明显的增加。50 mmol/L以后，随着缓冲液浓度的增加，后峰的洗脱强度又有所减弱。在50 mmol/L时，体系的基线平稳。综合洗脱强度、基线情况以及分离度因素,选择离子强度适中50 mmol/L时的浓度为当前体系的最佳缓冲液浓度。

3 结语

以β-CD-F2为手性选择剂制备的HPCE整体柱拆分手性药物拉米夫定对映体混合物，采用单一变量法，分别研究了Tris-磷酸缓冲液pH值、浓度、进样量、工作电压等对拆分拉米夫定对映体混合物的影响。通过对实验分离条件的选择优化，建立了手性药物拉米夫定对映体分离分析的HPCE新方法。结果表明，拉米夫定分子结构中含有羟基、氨基、羰基，有共轭体系的六元氮杂环和五元硫氧环及共轭双键等，易与β-环糊精的亲水羟基产生氢键作用，拉米夫定及其对映体直线型的分子结构使之易进入β-环糊精的疏水空腔内。β-CD-F2上存在羧基，其与拉米夫定的氨基，羟基产生静电引力、范德华力、氢键作用力，增强了HPCE整体柱的手性识别能力，增强了对拉米夫定对映体的手性拆分能力。通过优化实验数据分析可知，pH值5.20，Tris-磷酸缓冲液浓度为50mmol/L，检测波长为270nm，柱温20℃，工作电压为20kV，进样时间为5s时，拉米夫定对映体得到了较好的分离，分离度Rs可达到22.02，且拉米夫定外消旋体混合物手性拆分后两对映体的分离度明显优于已有HPLC拆分的文献[5]报道结果。

[1]Zhu Bolin,Xu Shuyin,Guo Xingjie,et al. Use of variousβ-cyclodextrin derivatives as chiral selectors for the enantiomeric separation of ofloxacin and its five related substancesby capillary electrophoresis[J]. J Sep Sci, 2017,40:1784-1795.

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[3]Marrone A,Capoluongo N,D'Amore C.Eighteen‐month lamivudine prophylaxis on preventing occult hepatitis B virus infection reactivation in patients with haematological malignancies receiving immunosuppression therapy[J].J Viral Hepat,2018,25:198-204.

[4]Warren Beach J,Lak S Jeong,Antonio J Alves.Synthesis of enantiomerically pure(2'R,5'5)-(-)-l-[2- (Hydroxymethyl)oxathiolan-5-yl]cytosine as a potent antiviral agent against hepatitis B Virus (HBV) and human immunodeficiency virus (HIV) [J].J Org Chem,1992,57:2217-2219.

[5]Nagasarapu Mallikarjuna Rao,Dannana Gowri Sankar. Development and validation of stability-indicating HPLC method for imeltaneous determination of Lamivudine,Tenofovir,and Dolutegravir in bulk and their tablet dosage form[J]. Future Journal of Pharmaceutical Sciences,2015,1:73-77.

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