奥利亚罗非鱼（WZ♀）×尼罗罗非鱼（XY♂、YY♂）杂交子代的性比分析

万松良 ，筴金华 ，任炳琛 ，魏志宇 ，张艳红 ，万珊

（1.湖北省水产研究所，湖北 武汉 430071；2.河北中捷国家级罗非鱼良种场，河北 沧州 061108；3.湖北省兽药监察所，湖北 武汉 430070）

罗非鱼种间存在雌性同形配子、雄性异形配子（XX♀/XY♂）和雌性异形配子、雄性同形配子（WZ♀/ZZ♂）等两种性别决定类型。已知莫桑比克罗非鱼Oreochromis mossambicus和尼罗罗非鱼O.niloticus属于前一类型，奥利亚罗非鱼O.aureus和荷那龙罗非鱼O.hornorum属于后一类型[1]。以往大量杂交实验证实，将某些不同性别决定机制的罗非鱼种间杂交，配子同型的XX型雌鱼与ZZ型雄鱼正交，可获得全雄或高雄性率子代，即雌雄性比为0∶1；配子异型的WZ型雌鱼与XY型雄鱼反交，杂交子代的雄性率一般为75%左右，即雌雄性比为1∶3[2]。但是，近年来，国内少数研究者对上述反交结果提出质疑，他们用WZ雌奥利亚罗非鱼与XY、YY雄尼罗罗非鱼杂交，其子代雌雄性比都为1∶1，故推断其中WY型杂交罗非鱼为雌性[3-5]。本研究在2010年至2014年测交筛选YY超雄尼罗罗非鱼的同时，也开展了奥利亚罗非鱼（WZ♀）×尼罗罗非鱼（XY♂、YY♂）测交实验，以验证WY型杂交罗非鱼的性比，并为育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源

奥利亚罗非鱼为中捷罗非鱼良种场从无锡淡水渔业中心引进的“夏奥1号”良种；尼罗罗非鱼系从上海海洋大学引进的第13代新吉富品系，其中YY超雄尼罗罗非鱼系本课题组筛选获得。

1.2 奥利亚罗非鱼（WZ♀）×尼罗罗非鱼（XY♂）杂交

根据孟德尔遗传学定律，WZ雌性奥利亚罗非鱼与XY雄性尼罗罗非鱼交配，子代将产生WX、WY、ZX、ZY等4种性别基因型，各占1/4，其中WX♀、ZX♂、ZY♂为已知性别，WY型的性别由同窝子代雌雄性比来判断，若性比为1∶1，则WY判断为♀；若性比为1∶3，WY判断为♂。

在两口4m×2m×1.5m的水泥池中各放1尾体质量1.4～1.5kg的雄亲鱼，再分别放入体质量0.4～0.6kg的雌亲鱼7尾（105#池）和4尾（106#池）。每尾亲本注射0.5个鲤脑垂体（PG）悬浮液催产。

本杂交父本为候选YY超雄鱼的材料鱼，在与奥利亚罗非鱼雌鱼交配见苗后，马上又与XX型雌性尼罗罗非鱼测交，用子代测试法验证其性别基因型为YY♂还是XY♂。

1.3 奥利亚罗非鱼（WZ♀）×尼罗罗非鱼（YY♂）杂交

根据遗传学原理，WZ雌奥利亚罗非鱼与YY超雄尼罗罗非鱼交配，子代只产生WY、ZY等两种基因型，各占50%，其中ZY♂为确认的杂种超雄鱼，WY型的性别可再由同窝雌雄性比来判断。若性比为1∶1，则WY为♀；若性比为0∶N（N表示测交子代总数）[6]，即子代是全雄鱼或高雄性率鱼，WY为♂；若性比为1∶3，则WY仍为♂，但否定父本是YY♂，而是XY♂。

在池塘内两口1.5m×1m×1m的32目网箱中，每箱放入测交筛选的、体质量1kg左右的YY超雄尼罗罗非鱼1尾，其中5～26#箱配体质量0.4～0.6kg的雌奥利亚罗非鱼2尾，5～27#箱配相似体质量的雌性奥利亚罗非鱼1尾，未注射催产剂。剪去YY超雄鱼的上颌，防止大个体雄鱼咬伤小个体雌鱼。各箱配组繁苗20d后，移走亲本，将子代单独饲养至性别鉴定。

YY超雄尼罗罗非鱼性别基因型分子标记鉴定：为重复验证用测交法筛选的YY超雄鱼的准确性，后期剪取每尾YY超雄鱼一小块尾鳍样品，装进1.5mL的编号试管中，经脱水处理后，与其他尼罗罗非鱼样品一起，送西南大学水产实验室作性别特异分子标记鉴定[7]，看两种鉴定结果是否相吻合。

1.4 子代雌雄鉴别

杂交子代个体一般长到50g左右时，性别特征已完全分化。此时随机捞取百尾以上样本或全部样本，逐尾观察肛门之后有无产卵孔来辨别雌雄，统计性比。也对少数体长达到4cm以上的子代，随机取出一部分，腹腔注射5%的冰醋酸固定液，解剖观察性腺，鉴别雌雄。

1.5 数据处理分析

用卡方分析检验各组合子代雌雄性比实验值与期望值的适合度，显著水平为P＞0.05或P＜0.001。观察所得的子代性别比例是否与期望值相吻合。

2 结果与分析

2.1 奥利亚罗非鱼（WZ♀）×尼罗罗非鱼（XY♂）杂交子代的性比

经7个半月的繁殖与饲养，两池都获得了大小两批杂种子代鱼，称重测算105#池有1 413尾，106#池有2 132尾。各池随机抽样鉴别雌雄结果见表1。105#池鉴鱼225尾，雄性率为49.3%，性比为1∶0.97。与1∶1的性比期望值作卡方分析，X2=0.018，P＞0.89，与期望值相吻合，由此判断105#池的WY型鱼为♀。106#池共鉴鱼204尾，雄性率为80.4%，性比为1∶4.1。与1∶1的性比期望值作卡方分析，X2=74.16，P＜0.001，与该期望值有极显著差异，而与1∶3 的期望值相吻合（X2=2.882，P＞0.089）。由此卡方分析判断，106#池中的WY型鱼应为♂。父本测交结果显示，105#池中父本子代的雄性率为64%，106#池中父本子代的雄性率为54%，确证两尾父本的性别基因型均为XY♂。

2.2 奥利亚罗非鱼（WZ♀）×尼罗罗非鱼（YY♂）杂交子代的性比

5-26#网箱繁殖杂交子代两窝，获苗较多，5-27#网箱只繁殖1窝，获苗较少。饲养8个月后，5-26#箱共鉴鱼506尾，雄性率为99.4%，雌雄性比1∶168（表2）。以雌雄比1∶1的期望值作卡方分析，X2=492.10，P＜0.001，与1∶1的期望值有极其显著的差异，而与0∶N（N表示杂交子代的总数）的期望值相吻合（X2=0.0124，P=0.92）。卡方分析证明，本箱中的WY型鱼为♂，父本为YY超雄鱼。5-27#箱仅有子代鱼20尾，雄性率为80%，雌雄性比1∶4。以雌雄性比1∶1的期望值作卡方分析，X2=6.05，P=0.0139，虽与1∶1的期望值有明显差异，但未达到极显著水平，而与1∶3的期望值相吻合（X2=0.067，P=0.80）。卡方分析表明，5-27#箱中的 WY型鱼也为♂，但父本可能不是YY型超雄鱼，而是XY型雄鱼。后与性别基因分子标记鉴定结果对照，发现5-26#父本性别基因型确为YY，5-27#父本性别基因型则为XY，后者性别基因分子鉴定与杂交子代性比结果相吻合，但与之前测交筛选YY超雄鱼（子代♀∶♂=5∶95，雄性率95%）的结果相矛盾。这就提示我们，尽管在测交过程中，子代抽样达100尾，雄性率高达95%以上，父本仍有可能不是YY超雄鱼。

为进一步验证5-26#网箱中近乎全雄的F1代尼奥罗非鱼中是否含有WY型雄鱼，从中随机取出少量性成熟个体，在网箱中与XX雌尼罗罗非鱼作测交实验。从理论上讲，WY型雄鱼与XX型雌鱼测交的后代（WX♀，XY♂）性比为1∶1，雄性率在50%左右，而YZ型超雄鱼与XX型雌鱼测交的后代（XY♂，XZ♂）雄性率至少应在90%以上。配组9箱，产苗4箱，3个月后检测F2代性比，除一口网箱的鱼苗太小没有鉴别外，其他3口网箱鉴别出两尾F1代WY♂（表3）。少量测交结果充分证实，由YY超雄尼罗罗非鱼与WZ雌性奥利亚罗非鱼杂交的全雄子代中含有大批WY型雄鱼，并非只是单纯的YZ型超雄鱼，直接证实了WY♂的存在。

表1 奥利亚罗非鱼（WZ♀）×尼罗罗非鱼（XY♂）杂交子代的性比Tab.1 The sex ratios of offsprings from blue tilapia Oreochromis aureus（WZ♀）×Nile tilapia O.niloticus（XY♂）crosses

表2 奥利亚罗非鱼（WZ♀）×尼罗罗非鱼（YY♂）杂交子代的性比Tab.2 The sex ratios of offsprings from blue tilapia Oreochromis aureus（WZ♀）×Nile tilapia O.niloticus（XY♂）crosses

表3 5～26网箱F1代雄性尼奥罗非鱼与正常XX雌性尼罗鱼测交后代的性比Tab.3 The sex ratios of offsprings from F1NO-tilapia male in cage 5～26 test crossed to normal XX female Nile tilapia O.niloticus

3 讨论

3.1 WY型罗非鱼的性别

综观以上4组实验的测交结果，除1组子代雌雄性比显示WY型罗非鱼为♀外，其他3组子代性比都表明WY型罗非鱼为♂。特别是YY超雄鱼为父本的组合中，子代雌雄性比为3∶503，接近0∶N的理论比值，雄性率高达99.4%,充分证实WY型罗非鱼的确为♂。用该组少量F1代尼奥全雄罗非鱼与XX雌性尼罗罗非鱼测交，也进一步证实了其中WY♂的客观存在（表3）。这一结果与以前万松良等[8]用YY超雄莫桑比克罗非鱼作父本测交的结果完全相似。在以前研究中，笔者用3尾YY超雄莫桑比克罗非鱼和3尾WZ雌性奥利亚罗非鱼分别测交，获得杂种子代800尾，一年性成熟后再逐尾检查性别，结果无一尾雌鱼，全部为雄性，雌雄性比为0∶800，完全符合0∶N的理论比值，证实WY型罗非鱼为♂。

基于以上研究结果认为，在绝大多数情况下，将种质纯正的WZ型奥利亚罗非鱼雌鱼与XY型、特别是YY型尼罗罗非鱼或莫桑比克罗非鱼雄鱼杂交，所获得子代雌雄性比为1∶3和0∶N，其中WY型罗非鱼的性别肯定为♂。这些结果也支持了笔者以前研究提出的罗非鱼4种配子性别基因强度顺序为Y♂＞W♀＞Z♂＞X♀的观念[8]。而少数研究者将4种配子性别基因强度顺序（或显隐性关系）修改为W♀＞Y♂＞Z♂＞X♀[4]，不符合大多数研究结果。

3.2 关于某些实验值偏离理论期望值的原因分析

虽然上述绝大多数实验获得的子代雌雄性比实验值都与1∶3和0∶N的理论期望值相吻合，但不可否认，本次实验中毕竟有一组子代的雌雄性比实验值为1∶1。而国内少数研究者（2012）用2尾XY♂和1尾YY♂尼罗罗非鱼分别与10尾和11尾WZ♀奥利亚罗非鱼测交实验，所得的子代雌雄性比值都为1∶1[3]。这种少数雌雄性比实验值偏离理论期望值的异常现象不容忽视，其原因值得深入分析探究。

尼罗罗非鱼是世界性养殖鱼类，大范围的推广养殖难免来自其他种类的基因渗入尼罗罗非鱼的基因组，造成种质不纯，降低养殖性能[9]。大量生产实践证实，两种性别决定机制的罗非鱼种间杂交，杂种后代的雄性率与亲本种质纯度密切相关，亲本种质纯度越高，雄性率也越高[10]，反之，亲本种质纯度降低，雄性率也降低。李思发等[11]研究指出，我国尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼养殖群体存在一定程度的遗传渐渗，有些杂种罗非鱼的外表酷似尼罗罗非鱼，这种杂种同正宗尼罗罗非鱼肉眼难以区分，误被当作尼罗罗非鱼而混入繁育群体。如果不纯的尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼杂交，或者其杂交种混杂进了父母本群体，尼奥鱼的雄性比将大幅降低，养殖性能降低。基于这种遗传渐渗理论推测，上述杂交子代雌雄性比实验值偏离预期值，下降为1∶1的意外结果，很有可能是因参与杂交的尼罗罗非鱼父本不纯所致。这种父本外形似尼罗罗非鱼，遗传本质却是奥利亚罗非鱼，它的杂交后代雌雄性比为1∶1就不足为奇了。

决定罗非鱼性别的遗传学机制复杂[12]。有些子代性比结果仅用单因子性染色体遗传或性配子决定理论解释还不够[13-16]。近期研究显示，奥利亚罗非鱼存在着两对性染色体[17]。罗非鱼的性别是以性别基因为主的多因子（如常染色体、亲鱼效应、环境等）共同作用来决定[18]。最近，Baroiller等[19]将尼罗罗非鱼的性别决定机制重新归纳成三点：①主要由遗传基因如性染色体主导；②某些次要因子如亲代效应，以及③环境如温度等因子共同引导性别。据此推测，以上少数杂交子代雌雄性比结果偏离预期值的原因，也可能与测交的父母本种群和个体的亲代效应有关联，即因杂交亲代的种群或个体不同，影响到杂种后代的雌雄性比偏离预期值。以上推测都有待进一步研究证实。

3.3 关于建立WY♀-YY♂的超雄罗非鱼自繁体系的可行性

本研究的初衷是想验证WY♀杂种罗非鱼是否客观存在。若存在，就可构建免测交的WY♀-YY♂超雄罗非鱼自繁体系。但本实验证实由YY超雄尼罗罗非鱼与WZ型奥利亚罗非鱼杂交产生的WY型杂种罗非鱼性别绝大多数不为♀，而为♂，因而也未完成构建WY♀-YY♂超雄罗非鱼自繁体系。

如上分析，在亲本种质不纯或可能存在种群不同的亲代效应的情况下，产生少数杂交后代的雌雄性比值偏离预期值的异常现象，但它并不能代表正常情况下绝大多数WY型杂种罗非鱼的性别为雄的遗传本质。若以这少数异常结果来推断绝大多数正常的WY型杂种罗非鱼的性别，就会得出以偏概全的结论。少数研究者仅用一尾YY超雄鱼作父本测交[3]，来推断子代WY型杂种罗非鱼为♀，其依据不够充分，结论值得商榷。

尼罗罗非鱼是罗非鱼类中个体最大、生长最快的优良种类。从遗传角度来说，即便WY型罗非鱼性别为♀，但因它属杂种，并不具备纯种尼罗罗非鱼的外形特征和生长优势。它需与YY超雄尼罗罗非鱼经过5代以上的回交和定向选种[4]，才能构建具有尼罗罗非鱼外形特征和生长优势的WY♀-YY♂型罗非鱼繁殖体系，过程相当费时费力。WY♀-YY♂的性别决定机制在本质上与WZ♀-ZZ♂一样，都是雌性异形配子和雄性同形配子，理论上并无创新。

综上所棕，目前建立WY♀-YY♂型超雄罗非鱼自繁体系是不可行的。而直接利用Y♂配子超强显性优势，将YY超雄尼罗罗非鱼与WZ雌性奥利亚罗非鱼杂交，生产具有全雄和杂种双重优势的奥尼罗非鱼，对促进单雄性罗非鱼养殖更具重大意义。

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