高压均质对大豆蛋白柔性和乳化性的影响及相关性分析

王喜波 徐晔晔 于 洁 王 健 王小丹 江连洲

(东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030)

0 引言

大豆分离蛋白(SPI)由于其高度的营养和功能特性而被广泛应用于许多基于蛋白质的食品配方中[1]。其中SPI柔性指的是当蛋白质所处周围环境变化时，其结构能够发生改变的能力[2]，通过蛋白酶消化检测的蛋白质结构柔性可能是控制乳化特性的重要结构因素[3]。TANG等[4]通过S-S裂解研究了牛血清白蛋白的构象柔性和乳化性质，发现蛋白质(在溶液中)的构象柔性在其乳化特性的不同方面起着至关重要的作用。高压均质是在制药、食品和化妆品领域研究中被广泛应用的一种非热技术，需要高能量输入来制备液滴尺寸在亚微米范围内的乳液，一般通过高剪切搅拌、高压均质机或超声波引发器获得[5]。在均质化过程中，流体受到空穴爆炸力、湍流、剪切、摩擦、热、压缩、加速、快速压降和碰撞等各种力的同时作用而形成一种精细的、均匀的乳液[6]。近年来对于高压均质对蛋白结构和功能性质之间构效关系的研究已经获得了广泛的关注，然而，关于高压均质对SPI柔性的影响及柔性与乳化特性相关性关系分析还鲜有报道。

本文将柔性的概念引入高压均质改性中，研究均质压力对SPI柔性、乳化特性以及其他结构特性的影响，并分析SPI柔性与乳化特性之间的关系，以期为实际生产提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆，由东北农业大学大豆研究所提供；大豆油，九三集团哈尔滨惠康食品有限公司；三氯乙酸，永华精细化学品有限公司；SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、胰蛋白酶、ANS荧光探针，Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T18 Basic型高速分散机/匀浆机，德国IKA公司；LD4-2A型低速离心机，北京医用离心机厂；实验型高压均质机，英国Stansted Fluid Power公司；TU-1800型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；ALPHA 1-4 LSC型冷冻干燥机，德国Christ公司；ALC-310.3型分析天平，德国艾科勒ACCULAB公司；紫外分光光度计，美国布鲁克海文仪器公司。

1.3 方法

1.3.1SPI制备

根据SORGENTINI等[7]的方法略作修改，大豆经粉碎机粉碎并过60目筛，再经索氏提取器用乙醚提取后获得脱脂豆粕。将脱脂豆粕与蒸馏水以料液比10 mg/L的比例混合。用2 mol/L NaOH调体系pH值为8.5，室温(20℃)低速搅拌2 h。离心(4 000g)20 min，取上清液，用2 mol/L HCl调pH值至4.5，4℃静置12 h，取沉淀进行离心(4 000g，5 min)，沉淀水洗两次，复溶后调pH值至7.0，预冻后进行冷冻干燥。

1.3.2SPI成分测定

蛋白含量测定采用凯氏定氮法(GB 5009.5—2010)；含水率测定采用直接干燥法(GB 5009.3—2010)；灰分含量测定参照GB 5009.4—2010；粗脂肪测定参照GB/T 14772—2008。

1.3.3样品制备

将SPI溶于缓冲液(0.2 mol/L、pH值7.0磷酸盐缓冲液)，质量浓度为5 mg/mL，室温搅拌2 h，再使用T18 Basic型高速分散机处理1 min，转速为10 800 r/min，然后在4℃静置水化12 h。

1.3.4高压均质处理

将制备好的样品取出搅拌均匀至室温，用高压均质机处理，设定均匀压力分别为0、40、60、80、100、120、140、160、180、200 MPa。

1.3.5柔性测定

参照KATO等[8]的方法略作修改。利用SPI对胰蛋白酶的敏感性来表征柔性。取250 μL 1 mg/mL酶液(0.05 mol/L、pH值8.0 Tris-HCl缓冲液)加入到4 mL 1 mg/mL处理后SPI蛋白溶液中(蛋白与酶质量比为16∶1)，38℃保温酶解5 min，酶解反应结束后，加4 mL 5% TCA(三氯乙酸)终止反应，离心后取上清液测定其在280 nm吸光度，用吸光度A表征量化柔性。

1.3.6表面疏水性测定

参照SCHMAL等[9]方法并略作改动。用浓度0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH值 7.0)将SPI样品溶液稀释到2 mg/mL，再稀释为样品质量浓度分别为0.1、0.05、0.002 5、0.001 25 mg/mL，加入20 μL的ANS(8 mmol/L ANS，溶于0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值7.0)荧光探针，混匀后在室温下避光15 min后测定SPI样品的荧光强度，同时设定激发波长为390 nm，发射波长为470 nm，狭缝宽度5 nm，测得的荧光强度对蛋白溶液质量浓度作图，选择线性关系良好的回归线斜率作为蛋白质表面疏水性指数。

1.3.7浊度测定

参照KURGANOV[10]的方法并略作改动。将处理后的SPI样品溶液稀释至3 mg/mL，混合均匀后在波长400 nm测定其吸光度，用所得光密度(OD值)表示浊度，所有测定结果重复3次。

1.3.8粒径测定

将处理过的SPI样品用去离子水稀释到1 mg/mL，在粒度测定仪上进行粒度的测定，每个蛋白样品检测3次。

1.3.9内源性色氨酸荧光光谱测定

参照LIU等[11]的方法并略作改动。处理后的SPI样品稀释到0.2 mg/mL进行测定，同时设定激发波长为290 nm，发射波长范围为300～460 nm，狭缝宽度均为2.5 nm，电压为700 mV进行荧光光谱扫描，所有测定结果重复3次。

1.3.10紫外扫描

参照LIANG等[12]的方法并略作改动。处理后的SPI样品稀释至0.2 mg/mL后进行紫外扫描，扫描波长范围150～500 nm，扫描速率100 nm/min，分辨率为0.2 nm，所有测定结果重复3次。

针对实例2，教师提出问题：将幼小植株在适宜条件下横放，一段时间以后，茎弯曲向上生长，根弯曲向下生长（图5）。一般认为，这是因为重力作用使得生长素分布不均匀，而且与根、茎对生长素的敏感程度不同有关，你能对这种现象作出合理解释吗？

1.3.11乳化性测定

参照TANG等[13]的方法。将处理后的SPI蛋白样品稀释到2 mg/mL，处理后蛋白样品与大豆油以体积比3∶1混合，分散机10 000 r/min处理1 min，迅速吸取底部乳液50 μL加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，在漩涡混合器上混合均匀。分别测定0 min和10 min时吸光度，乳化活性用吸光度A表示，乳化稳定性的计算公式为

式中E——乳化稳定性，min

A0——0 min时测得的吸光度

A10——10 min时测得的吸光度

1.3.12数据统计分析

每次试验做3次平行，结果用平均值±标准差表示，数据间差异显著性采用SPSS 17.0进行数据统计分析，试验数据用Origin 9.0绘制。

2 结果与分析

2.1 大豆分离蛋白的组成

试验制得的SPI蛋白质量分数、含水率、灰分质量分数和粗脂肪质量分数分别为(90.22±0.44)%、(3.24±0.67)%、(3.39±0.53)%和(0.47±0.56)%，符合试验要求[14]。

2.2 均质压力对SPI柔性的影响

在不同均质压力处理条件下，SPI柔性随着均质压力的增大而呈现增大的趋势，在均质压力范围为0～160 MPa时，SPI柔性随着均质压力的增大而增大，180 MPa时，柔性变化趋势不明显，这是因为高压均质产生了强大剪切力、撞击力及空穴爆炸力，均质压力处理对SPI的三级和四级结构有显著的影响，并通过非共价键的切割破坏了SPI蛋白内部的刚性结构[15-16]，导致柔性的上升，且随着均质压力的上升，破坏强度增大。当均质压力为200 MPa时，SPI柔性表现出下降的趋势，这可能是由于通过SH/S-S交换连接形成分子间二硫键，压力过大而引起了蛋白亚基的聚集[17-18]。

2.3 均质压力对SPI表面疏水性指数的影响

TEDFORD等[15]指出均质压力使弱氢键和分子间作用力之间裂解从而导致蛋白质分子结构的变化。SPI表面疏水性指数随着均质压力的增加而上升，表明高压均质的作用会使SPI蛋白质分子进一步伸展，原来隐藏在SPI内部的疏水基团随着均质压力的增加而逐渐暴露于外部，使得SPI结构变得更加伸展。当均质压力为200 MPa时，SPI表面疏水性指数大幅增加，这可能是因为高压处理SPI时强剪切力对SPI内部隐藏的疏水性基团进行切割，更多的疏水性基团暴露，SPI表面疏水性指数大幅增加，柔性随均质压力变化趋势与表面疏水性指数随均质压力变化的趋势相近。SPI表面疏水性指数的增加可以增强SPI的乳化活性，这是因为高压均质处理改善了大豆蛋白质，特别是β-伴大豆球蛋白的β-亚基和大豆球蛋白的酸性亚基吸附在油-水乳液的油/水界面处的能力[19]，因此，SPI表面疏水性指数的增加意味着乳化活性也随之增强。

2.4 均质压力对SPI浊度的影响

随着均质压力的增加，SPI浊度逐渐降低，这是因为未高压均质处理的蛋白质在底部沉积有大量高分子聚合物，蛋白质溶液不均匀，故SPI浊度较大。CROMWELL等[20]认为浊度与溶液中聚集体大小和数量有关，当较大的SPI颗粒在高压均质条件下处理后可以加工成稳定的乳液或悬浮液细颗粒，导致溶液浊度的降低，并且均质压力越大，浊度越低，这可能是由于高压均质处理产生了更加灵活和低分子量的聚集体，这些聚集体迅速移动到气-液界面并展开，导致表面张力的有效降低[21]。IBANOLU等[22]在乳清蛋白分离物中也发现了类似结果，推测蛋白质分子变得更小，更易于在高压下以更快的速度在界面吸附，形成均匀稳定的乳液，即浊度降低。

2.5 均质压力对SPI粒径的影响

图1 均质压力对SPI粒径的影响Fig.1 Effect of homogeneous pressure treatment on particle size of SPI

2.6 SPI内源性色氨酸荧光光谱分析

荧光光谱法是一种非常成熟的技术，用于观察蛋白质构象变化，以及研究蛋白质基质在加工或储存过程中的变化，在蛋白质中，主要的荧光基团是色氨酸的吲哚基团，其发射对溶剂极性非常敏感[26-28]。因此，蛋白质的荧光光谱由荧光氨基酸的化学环境决定，色氨酸(Trp)光谱的变化可以用于鉴定蛋白质的构象变化[29]。如图2所示，内源性荧光强度随着均质压力的增加而增加，这与浊度变化趋势一致，表明随着柔性的增加，SPI空间结构发生变化，色氨酸残基暴露于蛋白质分子表面，蛋白质的疏水区域局部改变，发色基团如色氨酸残基所处环境由非极性向极性转化，这可能是由高压均质处理导致SPI蛋白分子部分解折叠造成的，即随着柔性的增加，SPI三级结构变得更加舒展。

图2 SPI内源性色氨酸荧光光谱分析Fig.2 Analysis of endogenous tryptophan fluorescence of SPI

2.7 SPI紫外扫描光谱分析

蛋白质产生紫外吸收主要是由于蛋白中的发色基团对紫外光的吸收作用，发色基团包括色氨酸和酪氨酸残基侧链基团，根据对紫外光谱吸收的不同，可以推断蛋白质分子构象的变化[30]，如图3所示，随着均质压力的增加，紫外吸收下降，说明SPI分子中具有紫外吸收的氨基酸残基(如酪氨酸残基等)因均质处理而暴露在蛋白分子的表面，发色基团所处的环境由非极性向极性变化，均质处理促使蛋白多肽链局部展开，蛋白分子柔性增大。这与浊度变化趋势一致。这更加印证了内源性色氨酸荧光光谱的结果，随着蛋白柔性的增加，SPI结构变得更加的舒展。

图3 SPI紫外图谱分析Fig.3 Analysis of SPI by ultraviolet scanning spectrometry

2.8 均质压力对SPI乳化活性和乳化稳定性的影响

如图4所示，当均质压力不大于160 MPa时，乳化活性随着均质压力的增加而增加，这与杨盛楠等[31]的结果一致，即在一定均质压力范围内，随着均质压力的增大，SPI乳化活性增加，当压力为160 MPa时乳化活性最大，随后乳化活性又呈现下降的趋势，而乳化稳定性随着均质压力的变化趋势与乳化活性随均质压力的变化趋势相似，当压力为180 MPa时乳化稳定性最大，这与柔性变化趋势较相近。SPI柔性增强，原先包含在分子内部的疏水性基团暴露出来，增强了蛋白的亲油性，宏观表现为蛋白乳化能力的提高。

图4 均质压力对SPI乳化特性的影响Fig.4 Effect of homogeneous pressure treatment on emulsification properties of SPI注：不同大写字母表示乳化稳定性差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示乳化活性差异显著(P<0.05)。

2.9 SPI柔性与乳化性的关系

由图5、6可知，在各高压均质压力条件下，随着柔性的增加，乳化活性和乳化稳定性均呈现递增趋势，具有良好的线性相关关系，其中，SPI柔性与乳化活性、乳化稳定性的线性拟合模型函数分别y=1.485 8x+0.016 9、y=34.062x+3.520 6，相关系数分别为0.893、0.938，当均质压力为180 MPa时，SPI柔性与乳化稳定性可以达到最大，且高压均质处理对乳化活性和乳化稳定性的影响略大于柔性。

图5 柔性与乳化活性的关系Fig.5 Relationship between flexibility and emulsifying activity of SPI

图6 柔性与乳化稳定性的关系Fig.6 Relationship between flexibility and emulsification stability of SPI

中性大豆蛋白经过高压均质处理可以提高这些蛋白的乳化活性[32]，形成具有抗絮凝现象和高界面蛋白浓度的油滴乳液[15]，YU等[33]发现高压均质处理可以改善贻贝分离蛋白的乳化活性和乳化稳定性。关于柔性和乳化性的关系研究，其中KITTIPHATTANABAWON等[34]认为，蛋白质的乳化性与分子的柔性有关，柔性的增加可以促进蛋白质分子向界面移动，并有助于蛋白分子在界面上发生重排，王喜波等[35]的研究结果表明，超高压(100～450 MPa)均质处理条件下，SPI柔性与乳化活性、乳化稳定性呈正相关关系。

3 结论

(1)当均质压力为0～160 MPa时，SPI柔性随着均质压力的增加而增加，160～180 MPa时柔性变化不明显，当均质压力为180～200 MPa时，SPI柔性又呈现下降的趋势。

(2)表面疏水性随着均质压力的增大而增大，而浊度则随之减小。乳化特性随均质压力的变化趋势与柔性随均质压力的变化趋势相似，紫外扫描、内源性色氨酸荧光光谱研究发现，随着SPI柔性的增加，其结构变得更加舒展。

(3)在不同均质压力处理条件下，SPI柔性与乳化活性和乳化稳定性呈显著性正相关关系，相关系数分别为0.893和0.938。

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