苯系物对皱纹盘鲍的急性毒性效应

许翠娅，杨 芳，罗冬莲，陈小红，魏姗姗，余 颖，陈财珍

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；2.福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建 厦门 361013)

苯系物(BTEX)属于单环芳香烃类，是石油类物质中常见的烷基苯类化合物，广泛存在于化工行业或石油相关行业中[1]。苯系物易挥发，具有一定的溶解性，随着石油工业的迅速发展，在采油、炼油、石油运输等过程中，苯系物很容易进入大气和水体中，进而对生态系统、水生生物和人类健康造成威胁[2]。目前，国内外有关苯系物的研究主要集中于大气、土壤、沉积物和淡水，对海水中苯系物的研究相对较少。对海洋环境中苯系物的研究集中于苯系物的检测技术、微生物修复等，关于苯系物的水生生态毒性报道相对较少[3-6]，《海水水质标准》(GB 3097—1997)中也没有苯系物的标准限值。

海洋贝类对环境污染物具有很强的富集性，通常被用作海洋污染物的指示生物。皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)具有很高的经济价值，是目前我国最广泛的贝类养殖品种之一，也是福建海域贝类养殖的主导种之一。目前关于苯系物对海洋贝类的生态毒理学研究尚不多见[6]，对皱纹盘鲍的毒性效应研究也尚未见相关报道。因此，开展苯系物对皱纹盘鲍的毒性效应研究可以考察贝类对苯系物污染的耐受能力和海洋生态系统的健康水平，可为评估苯系物对海洋环境和水产品质量安全的风险提供基础数据和科学依据，并为科学制订苯系物的水环境质量标准提供理论依据，在海洋环境中苯系物泄露的突发事件处理中，本研究成果也可为管理部门的决策提供技术支撑和科学依据。

1 材料与方法

1.1 受试生物

试验用皱纹盘鲍均购自福建省东山县马鞍屿水产养殖场，选择活力好、健康、无外伤的鲍，采用网兜扎紧(20只/袋)、冰块降温的方法，约2 h运输到福建省水产研究所生态实验室。将鲍置于规格5 L的玻璃烧杯，按试验密度进行暂养(20只·5 L-1)，以避免二次转移对鲍造成的机械损伤。暂养7 d，期间每日定时换水和投喂江蓠，全天充气，暂养期间鲍活力良好、摄食正常，死亡率为0.5%，符合急性毒性试验标准(<10%)[7]。试验前24 h停止喂食。试验前随机抽取50只鲍进行生物性状测量，试验鲍壳长为(3.8±0.5)cm，体重为(6.2±2.0)g。

1.2 试验药剂与仪器

试验药剂：苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯和无水乙醇，均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产。母液配制：试验使用助溶剂无水乙醇配制母液，母液于每次试验前配得，当日使用，助溶剂不超过0.1 mg·L-1[7]。试验常规理化因子(水温、盐度、pH和溶解氧)用WTW Multi3430多参数分析仪进行测定。

1.3 试验方法与条件

试验在5 L的玻璃烧杯中进行，试验溶液体积为5 L，每个烧杯放入20只鲍。试验周期为96 h，期间不喂食。为满足试验鲍对溶解氧的需求，试验海水在使用前充分曝气，试验期间采用不间断微充气的方法，保证试验水体中溶解氧≥4 mg·L-1。为保证毒性试验过程中溶液浓度保持在初始浓度的80%以上[7]，试验容器玻璃烧杯采用保鲜膜、Parafilm封口膜和锡箔纸封口。试验方式为半静态，每12 h换1次水并检查记录鲍死亡情况，挑出死亡鲍(死亡判定标准：腹足无自主吸附力，通常腹足朝上，无法翻转，个别靠物理吸附力附着但脱落后无法再吸附，多次触碰后无反应)。

依据相关急性毒性试验方法[7-8]，经预实验，分别确定苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯的正式试验浓度范围，按等对数间距法设置5个质量浓度梯度组，每个浓度组设3个平行组，并设空白对照组(不添加任何试剂)和助溶剂对照组(无水乙醇浓度100 μL·L-1)。根据预试验结果，苯正式试验浓度设置为24.91、31.04、38.66、48.16和60.00 mg·L-1；甲苯正式试验浓度设置为22.92、28.34、35.03、43.30和53.53 mg·L-1；邻二甲苯和间二甲苯的正式试验浓度设置为10.00、13.99、19.58、27.39和38.32 mg·L-1；对二甲苯正式试验浓度设置为3.62、5.00、6.90、9.52和13.13 mg·L-1。

试验所用的海水取自厦门海域，经沉淀砂滤后使用，添加海水晶调节盐度至(30.0±0.1)，在实验室充分曝气备用。试验期间海水水温为(19±1)℃，pH为 7.22～8.09，溶解氧为4.77～9.72 mg·L-1。

1.4 数据处理

试验结果采用SPSS 23软件进行分析，利用Pearson相关分析判断剂量和死亡率的相关性，然后进行概率回归分析，求得LC50值及其95%置信区间和回归方程。

安全浓度(SC)的计算公式：SC=96 h LC50(96 h半致死浓度)×AF(应用系数)，一般来说，对不稳定而又很少产生残留的化学物质，常用0.1作为应用系数[9]，依据苯系物的化学特性，AF取值0.1。

2 结果

2.1 中毒症状

试验鲍在5种苯系物溶液中的中毒症状相似，试验中观察到，随着药物浓度的增加和时间的推移，试验鲍分泌大量的黏液，呈泡沫状浮于水面(高浓度组尤为明显)，试验水体逐渐变浑浊。在较高浓度苯系物的海水中，鲍中毒反应明显，表现为：试验鲍明显不适，初时鲍壳左右扭转，一段时间后鲍肌肉松弛，附着力减弱，渐渐脱离杯壁，腹足朝上卧于杯底，腹足蠕动挣扎但无法翻身，逐渐死亡；个别试验鲍挣扎后静卧于杯底，逐渐死亡。

在低浓度苯系物的海水中鲍中毒反应较不激烈，中毒后死亡的鲍一般表现为：初时试验鲍紧闭壳吸附于杯壁，一段时间后鲍肌肉松弛，附着力减弱，渐渐脱离杯壁，腹足朝上卧于杯底，腹足蠕动但无法翻身，逐渐死亡；部分试验鲍无明显挣扎，静卧于杯底死亡；个别试验鲍静静吸附于杯壁，人工剥离后触之无反应，已死亡。

濒死的鲍活力明显下降，附着力弱，触角和腹足肌肉松弛，触之反应迟钝，呈麻痹状。中毒症状较轻的鲍一般不喜活动，附着力较弱，容易被剥离杯壁。对照组的鲍一般白天紧附于杯底，吸附力强，夜间活动。

2.2 苯系物对皱纹盘鲍的急性毒性

试验过程中，空白对照组和助溶剂对照组的试验鲍均未死亡，符合急性毒性试验标准方法的要求[7]。急性毒性试验结果显示，不同浓度的药物对皱纹盘鲍造成不同程度的毒害，随药物浓度的增加和试验进程的推进，鲍死亡率呈逐渐上升的趋势(图1～图5)。对苯系物浓度和皱纹盘鲍死亡率进行剂量-效应相关性分析，得到Pearson相关系数(表1)，试验结果表明，5种苯系物对皱纹盘鲍毒性作用存在明显的剂量-效应相关关系。

在苯的急性毒性试验中，最低浓度组(24.91 mg·L-1)在72 h内鲍没有出现死亡，96 h鲍的死亡率为8.5%；最高浓度组(60.00 mg·L-1)24 h和48 h鲍的死亡率分别为55.0%和100%。苯对皱纹盘鲍的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分别为57.11、41.23、38.25和33.37 mg·L-1，苯系物对皱纹盘鲍24 h、48 h、72 h和96 h LC50的95%置信区间见表1，其中苯对皱纹盘鲍96 h LC50的95%置信区间为30.40～36.39 mg·L-1。

在甲苯的急性毒性试验中，最低浓度组(22.92 mg·L-1)在24 h内鲍没有出现死亡，48 h鲍的死亡率为5.0%，96 h鲍的死亡率为32.5%；最高浓度组(53.53 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鲍的死亡率分别为75.0%、85.0%和100%。甲苯对皱纹盘鲍的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分别为46.14、37.98、30.38和25.24 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信区间为23.03～27.01 mg·L-1。

在邻二甲苯的急性毒性试验中，最低浓度组(10.00 mg·L-1)在96 h内鲍没有出现死亡；13.99 mg·L-1浓度组在48 h内鲍没有出现死亡，72 h和96 h鲍的死亡率分别为35.0%和50.0%；最高浓度组(38.32 mg·L-1)24 h和48 h鲍的死亡率分别为52.5%和100%。邻二甲苯对皱纹盘鲍的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分别为37.51、23.34、17.91和15.61 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信区间为13.88～17.40 mg·L-1。

在间二甲苯的急性毒性试验中，最低浓度组(10.00 mg·L-1)在48 h内鲍没有出现死亡，72 h和96 h鲍的死亡率分别为15.0%和20.0%；最高浓度组(38.32 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鲍的死亡率分别为62.5%、80.0%和100%。间二甲苯对皱纹盘鲍的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分别为35.61、25.96、15.12和12.84 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信区间为11.55～14.20 mg·L-1。

在对二甲苯的急性毒性试验中，最低浓度组(3.62 mg·L-1)在48 h内鲍没有出现死亡，72 h和96 h鲍的死亡率分别为1.5%和8.5%；最高浓度组(13.13 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鲍的死亡率分别为67.5%、92.5%和100%。对二甲苯对皱纹盘鲍的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分别为11.07、7.69、5.43和4.81 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信区间为4.42～5.25 mg·L-1。

国家环境保护总局1986年制订的《环境监测技术规范 第四册 生物监测(水环境部分)》中，将化学物质对水生生物的毒性划分为5个等级：LC50<1 mg·L-1为剧毒；LC50=1～100 mg·L-1为高毒；LC50=100～1 000 mg·L-1为中毒；LC50=1000～10 000 mg·L-1为低毒；LC50>10 000 mg·L-1为微毒或无毒。参照此标准，苯、甲苯和3种二甲苯对皱纹盘鲍均为高毒物质。经验公式计算结果：苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯对皱纹盘鲍的安全浓度分别为3.34、2.52、1.56、1.28和0.48 mg·L-1。

表1 苯系物对皱纹盘鲍的LC50及毒性试验回归方程

续表1

注：Y为死亡率；X为物质浓度对数。

Notes：Ywas mortality rate；Xwas substance concentration logarithm.

3 讨论

苯系物为一类易挥发的单环芳香烃类化合物。有机污染物毒性作用可分为麻醉型毒性和反应型毒性[10]。麻醉型毒性有机物对生物的毒性较低，通常表现为不同程度的致麻醉作用。致麻醉作用几乎是所有有机物最起码的生物效应，称为基本毒性。麻醉型毒性又分为非极性麻醉和极性麻醉。非极性麻醉型化合物为疏水性物质，不与生物大分子结合，其急性毒性主要表现为对膜的穿透破坏作用。极性麻醉型化合物是分子结构中具有强失电子的氨基、羟基的芳烃化合物，其毒性作用高于基本毒性[11]。从皱纹盘鲍的中毒症状来看，试验鲍出现了反应迟钝、肌肉松弛、附着力减弱等麻醉状态，符合麻醉型毒性的中毒症状。

急性毒性试验结果表明，5种苯系物对皱纹盘鲍毒性大小顺序为：对二甲苯>间二甲苯>邻二甲苯>甲苯>苯。以96 h LC50来比较，对二甲苯的毒性效应相当于7倍苯的毒性效应，约等于5倍甲苯的毒性效应；邻二甲苯和间二甲苯对皱纹盘鲍的毒性效应差异不显著，对二甲苯对鲍的毒性效应约等于3倍邻、间二甲苯的毒性效应。一般认为，非极性麻醉型化合物引起麻醉的能力主要与疏水性大小有关，根据相似相溶原理，生物体内细胞膜及细胞中的类脂物质都会吸附麻醉化合物，疏水性越大，则非极性麻醉型化合物就越容易非选择性地透过细胞膜，所以非极性麻醉型化合物的毒性大小可以根据辛醇-水分配系数来确定[12]。我国学者王连生等和戴朝霞等认为，芳香烃类有机物分子结构会影响生物活性以及毒性作用大小，化合物分析结构大小贡献的顺序为：疏水性>亲水性>电性效应>空间效应[13-14]。本试验中的苯系物均属非极性麻醉型化合物，苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯20℃辛醇-水分配系数logKow分别是2.13、2.69、2.77、3.20和3.15 mg·L-1[15]，所以它们的疏水性大小顺序为二甲苯>甲苯>苯。根据以上理论，二甲苯更容易通过皱纹盘鲍的细胞膜并对其产生毒性作用，其次为甲苯和苯。这与本试验得到的结果相吻合。

姜北、范亚维等、李学峰等、郑师梅等也开展了苯系物的急性毒性研究[5，16-18]，姜北在苯系物对仿刺参的急性毒性试验的研究表明，6种苯系物对仿刺参的毒性效应大小顺序是：对二甲苯>间二甲苯>邻二甲苯>乙苯>甲苯>苯，苯系物对仿刺参的96 h半数致死浓度分别是：苯101.61 mg·L-1、甲苯58.28 mg·L-1、乙苯43.42 mg·L-1、邻二甲苯34.58 mg·L-1、间二甲苯27.19 mg·L-1、对二甲苯20.25 mg·L-1。此研究结果中苯系物毒性效应大小顺序与本试验的结果一致。范亚维等的研究表明，水体中甲苯、乙苯和二甲苯对斑马鱼96 h LC50分别为77.5、31.0和34.8 mg·L-1；李学峰等的研究结果为，甲苯、乙苯和二甲苯对中华新米虾的96 h LC50分别为13.8、10.4和11.3 mg·L-1，二者的研究结果均表明3种苯系物的毒性大小顺序为乙苯>二甲苯>甲苯，也与本研究结果相似。郑师梅的研究表明，在预实验中，苯系物引起铜绣环棱螺死亡的浓度高达500 mg·L-1，远远高于引起螺行为变化的浓度，试验以螺的行为变化作为毒性效应指标来研究苯系物对铜绣环棱螺的急性毒性，结果表明：甲苯、乙苯和二甲苯对铜锈环棱螺不良反应的96 h EC50分别为37.2、13.3和8.9 mg·L-1，毒性大小顺序为二甲苯>乙苯>甲苯。铜锈环棱螺和皱纹盘鲍均隶属于软体动物门腹足纲，从试验结果来看，苯系物对皱纹盘鲍的毒性效应明显大于对铜锈环棱螺的毒性效应。从以上研究结果来比较，相对于仿刺参、斑马鱼、中华新米虾、铜绣环棱螺，皱纹盘鲍对苯系物的敏感程度相对较高。

目前《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)、《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)中对集中式生活饮用水地表水源中的苯系物规定了标准限值，苯、甲苯和二甲苯的标准限值分别为0.01、0.7和0.5 mg·L-1，而《海水水质标准》(GB 3097—1997)和《渔业水质标准》(GB 11607—1989)中均无苯系物标准限值。苯、甲苯、二甲苯均具有很强的生物毒性，对人体而言，苯的毒性最大，已确定为致癌物，可导致白血病和淋巴瘤[19]，还具有致畸作用，引起染色体断裂和阻碍染色体分离[20]；甲苯具有神经毒性和致畸作用[21]；二甲苯对人的神经系统、肝脏和肾脏具有损伤作用[22-23]。依据其对人体的危害程度，相关饮用水卫生标准对苯系物的标准限值，尤其是对苯进行了严格的规定。不同的生物对污染物的敏感性存在差异，目前苯系物对水生生物的毒性效应研究开展得较少，对苯系物中毒机制的研究也不够深入，因此亟需开展相关研究，为科学制订苯系物水环境质量标准以及排放标准提供理论依据。

致谢：福建省水产研究所的郑惠东、王雪玲、马文学、陈月忠、钱小明、陈思等参与了本试验，谨致谢忱。

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