羊蹄甲白粉病的首次报道

冯皓 宋慧云 祝一鸣 吴文佳 李亭潞 徐春玲 单体江

摘 要 羊蹄甲是我国华南地区重要的园林景观树种，近年来随着栽培面积的不断扩大，白粉病的发生也越来越严重。通过对羊蹄甲白粉病的症状及病原菌分生孢子形态学特征进行描述，根据核糖体DNA-ITS序列发现，羊蹄甲白粉病病原菌与Erysiphe lespedezae（登录号：KP794926）相似性为100%，初步鉴定该菌为子囊菌门白粉菌属（Erysiphe sp.）真菌（登录号：KX960783），目前在野外尚未發现该病原菌的有性世代。该研究结果为羊蹄甲白粉病的首次报道，为羊蹄甲白粉病的鉴定及防治提供了重要的理论依据。

关键词 羊蹄甲；白粉病；病原鉴定

中图分类号 S436.8 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.017

Abstract Bauhinia purpurea Linn. was an important landscape tree species in the southern China. In recent years， with the growing hectare of planting，the occurrence of powdery mildew had become more and more serious. This study described the symptoms of powdery mildew and the morphological characteristics of conidia. The ribosomal DNA-ITS sequence was 100% similar to Erysiphe lespedezae （accession number was KP794926）， which was identified as Erysiphe sp. （accession number was KX960783）At present， the sexual generation had not found in the wild. This study was the first report on the powdery mildew of Bauhinia purpurea Linn.， which provided important theoretical basis for the identification and control of powdery mildew.

Keywords Bauhinia purpurea Linn. ； powdery mildew ； pathogen identification

羊蹄甲属是紫荆族中最大的一个属，全世界约有300种，在我国主要分布在广东、广西、海南、福建等省[1-2]。羊蹄甲属植物花朵繁盛，花色艳丽，具有很强的空气净化能力，是华南地区优质的庭荫树、行道树和园林绿化树种[3]。随着广东省四大重点林业生态工程建设工作的不断推进以及人们对观赏植物需求量的日益增多，羊蹄甲属植物开始在华南地区尤其是广州市大面积种植[4]。然而，单一品种大面积连片种植往往会诱发病虫害的发生和流行，严重危害城市绿化和生态文明建设，因而，研究羊蹄甲属植物病害具有重要的理论和实践意义[5]。当前，有关羊蹄甲属植物病害的研究较少，主要集中在灰斑病（Phyllosticta bauhiniae Cooke）、褐斑病（Pseudocercospora bauhiniicola （Yen）Yen）和叶霉病（Cladosporium cladosporioides）等[6-7]。羊蹄甲（Bauhinia purpurea Linn. Sp.），又名玲甲花，隶属苏木科（Caesalpiniaceae）羊蹄甲属（Bauhinia）常绿乔木。调查显示，白粉病是一种危害羊蹄甲叶片和嫩枝的病害。随着羊蹄甲的大面积种植，白粉病发病程度在逐年加重，严重影响羊蹄甲的观赏价值。目前尚未见羊蹄甲白粉病的任何研究和报道。本研究描述了羊蹄甲白粉病的危害症状，并结合形态学和分子生物学对羊蹄甲白粉病的病原菌进行鉴定，为羊蹄甲白粉病的鉴定以及综合防控提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病害标本采集

病害标本采自广州市天河区华南农业大学校园，将标本置于自封袋中，置于4℃保存，备用。

1.1.2 仪器与试剂

光学显微镜（蔡司金相显微镜Axio Scope A1）；SW-CJ-2G型超净工作台（苏州净化设备有限公司，苏州）；0.2%氯化汞（广逸化工有限公司）；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；引物ITS4（上海生工生物工程有限公司）；引物ITS5（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 发病症状及病原菌形态观察

观察羊蹄甲白粉病的发病症状，包括病斑的形状、大小、色泽及病害对羊蹄甲植株的危害（枯萎、凋谢、畸形、变色、生长习性变化等）。用灭菌针挑取新鲜病叶表面的白色粉层少许，做成临时玻片，用光学显微镜仔细观察病原菌的形态特征，测量50个病原菌分生孢子大小并显微拍照[8-9]。

1.2.2 病原菌ITS序列测定

用灭菌的挑针轻轻刮取白色粉状物，液氮研磨，采用试剂盒法（上海生工DNA抽提取试剂盒）提取DNA。用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）对DNA进行PCR扩增，反应体系为：PCR反应混合液总体积为50 μL，包括DNA Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模版3 μL，双蒸水补足到50 μL混匀，离心后放入PCR仪扩增。扩增条件为94℃变性3 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸8 min，4℃保存[10]。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，委托上海生工生物工程有限公司测序。所得序列使用DNAMAN软件进行互补，将正向与反向引物互补序列两端加上引物序列拼接成完整序列，所得的rDNA-ITS序列提交到GenBank数据库（National Center for Biotechnology Information website [http：//www.ncbi.nlm.nih.gov]），利用Blast工具进行序列比对，找出与该序列相似度最高的病菌序列信息，对该病菌样本进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 羊蹄甲白粉病症状

羊蹄甲白粉病菌为专性寄生菌，在羊蹄甲属的其他种尚未见白粉病的发生。据调查，羊蹄甲白粉病在华南地区2月下旬开始发病，一直持续到6月份，发病时间受温度以及降雨量的不同会有所变化，一般3～4月份发病最为严重。该病害主要为害羊蹄甲叶片和叶柄，严重时可危害新发嫩枝。叶片正反面皆可侵染，发病初期叶面出现褪绿小点，随后扩展为不规则形水渍状病斑，当条件适宜时，叶片表面放射状的白色菌丝会不断生长并产生大量白色粉末状的分生孢子，覆盖整个叶片。感病叶片轻者褪绿、黄化、卷曲、皱缩，严重时叶片畸形，质地变硬，失去光泽（见图1）。

2.2 病原菌形态特征

病原菌分生孢子呈圆筒形或椭圆形，两端圆，单胞，无色，表面不光滑，大小为长32.0～46.0 μm，宽13.0～20.0 μm，平均长×宽为39.5 μm×16.5 μm（见图2）。分生孢子内含明显的纤维状体，纤维状体盘状。

2.3 病原菌ITS序列测定

利用真菌核糖体DNA-ITS区通用引物 ITS4和ITS5，以羊蹄甲白粉病病原菌总DNA为模板进行PCR扩增，获得一条长度为672 bp大小的目的片段。将ITS序列提交至GenBank 数据库中，获得羊蹄甲白粉病菌ITS序列的登录号为KX960783 。在NCBI中进行BLAST，与其他同源序列比对分析后发现，羊蹄甲白粉病病原菌与Erysiphe lespedezae（登录号为KP794926）核糖体DNA-ITS序列的相似性高达100%。Erysiphe lespedezae属于子囊菌门白粉菌属，为有性态，但目前在野外尚未发现羊蹄甲白粉病菌的有性世代。

3 讨论

目前在园林应用中常见的品种主要包括洋紫荆、羊蹄甲、白花洋紫荆、红花羊蹄甲、嘉氏羊蹄甲等。除嘉氏羊蹄甲外，其他几种植物较为相似，不易区别，导致常混种[3]。调查显示，白粉病只危害羊蹄甲，在羊蹄甲屬的其他植物上尚未发现。由于白粉病菌属于典型的活体寄生， 即菌丝体只能存活在活的寄主组织内，无法用培养基离体培养[11-12]，因此，给病原菌形态学、生物学和分子生物学等方面的研究带来了一定的困难。本研究通过分子生物学方法将羊蹄甲白粉病病原菌鉴定为子囊菌门白粉菌属（Erysiphe sp.），但目前在野外尚未发现羊蹄甲白粉病菌的有性世代，而白粉病菌的无性态多属于半知菌类粉孢属（Oidium sp.）真菌。本研究仅从白粉病症状和白粉病病原菌分生孢子的显微图片方面不足以鉴定该病原菌无性态的分类地位，因此，在今后的研究中还需对分生孢子以及分生孢子梗的着生方式等方面做进一步研究。

白粉菌属（Erysiphe）真菌广泛分布于世界各地，是危害农林作物的一种重要病原物。相比瓜果蔬菜、小麦大豆等经济作物，由于其不进行系统侵染，特别是很少侵染根部，病害发展缓慢，寄主死亡率低，往往在林业生产实际中不受重视[13]。华南地区观赏植物种类繁多，白粉菌的侵染无需特定的温度、湿度[12]，当病害流行时，亦会造成严重的损失[14]。比如，常见的马占相思白粉病[11]、九里香白粉病[15]、橡胶树白粉病[16]、玫瑰白粉病[17]等。因此，准确鉴定白粉病病原菌是开展抗病育种工作的首要问题。本研究通过形态学和分子生物学方法对羊蹄甲白粉病病原物进行了鉴定，这是我国首次关于羊蹄甲白粉病病原菌的报道，为今后进一步研究羊蹄甲白粉病病原菌的生物学特性、发生规律、抗病育种以及筛选有针对性的高效药物提供了一定的理论依据。

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