竹荪连作土壤拮抗细菌的分离鉴定及抑菌活性

张月珠 蒋文静 常颖萃 牛蓉 叶舟

摘 要 通过分离鉴定竹荪连作土壤中拮抗细菌，研究其抑菌作用。采用稀释平板涂布法，通过形态、生理生化特性及16S rDNA测序分析等方法分离、鉴定竹荪菌拮抗细菌，用平板对峙试验探究该菌对竹荪菌丝生长的抑制作用。结果表明，从竹荪连作地土壤中分离出1株对竹荪菌丝生长具有明显抑制作用的菌株。经鉴定，该菌株为巨大芽孢杆菌。平板对峙试验表明，该菌及其发酵液均对竹荪菌丝生长具有抑制作用，抑制率分别为58.37%、64.81%，而经高温灭菌和过滤膜除菌后的发酵液对竹荪菌丝生长的抑制率大大降低，说明发酵液所产生的抑菌物质可能是一种对高温敏感的蛋白质，该结论为竹荪连作障碍的全面解析提供理论依据。

关键词 竹荪 ；巨大芽孢杆菌 ；抑菌活性 ；连作障碍

中图分类号 S482.7 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.016

Abstract This study screened out antagonistic bacteria in continuous cropping soil of dictyophora and analyzed its antibacterial activity. The bacteria were isolated by plate dilution method and the strains were identified by microscopic observations， biological identification and 16S rDNA sequence analysis. The plate confrontation test were used to analyze the anti-microbial activity.The results showed that there was one bacteria showed great antibacterial activity on dictyophora. The bacteria was Bacillus megatherium. The plate confrontation test showed that Bacillus megatherium and its fermentation broth had inhibiting effect on the growth of dictyophora with the efficacy of 58.37% and 64.81%. However， biological inhibition was greatly declined when the fermented liquid was sterilized with high temperature and aseptic filtration.The antibacterial was a kind of protein which was sensitive to the high temperature. This paper could provide theoretical basis for the consecutive monoculture problems of Dictyophora.

Keywords Dictyophora echinovolvata ； Bacillus megatherium ； anti-microbial activity ； consecutive monoculture problem

竹荪（Dictyophora）属于真菌，是对竹荪属（Dictyophora Desv）的总称，别名竹笙、竹菌、竹参、网纱菇、竹签，为名贵的食用菌。近年来，福建、湖南、贵州等省的竹荪栽培生产发展迅速，栽培规模不断扩大，产量不断提高，竹荪栽培已成为当地特色产业和重要经济来源。但连作障碍问题使得二茬竹荪产量下降，持续连作减产幅度更大，严重影响竹荪产业的发展。

农作物连作障碍一般为诸多因素综合影响的结果[1]。首先，土壤的肥力與农作物的产量和品质存在着密切的关系[2]。其次，作物生长过程中，根系常会分泌对自身有害的化合物[3-4]，且长期连作，根系的微生物群落会发生变化或者结构被打破，病原微生物数量增加，影响作物的正常生长与发育[5-8]。因食用菌栽培生产连作障碍的特点、发生机制有别于植物连作障碍，竹荪连作土壤中是否存在竹荪菌的拮抗细菌，竹荪菌与土壤拮抗细菌的互作是否为竹荪连作障碍的重要原因，目前都尚未见相关研究。但在某些地区，连作障碍问题已严重影响食用菌产业的健康发展。本文通过对竹荪连作土壤竹荪菌拮抗细菌的分离鉴定及抑菌作用进行研究，探讨竹荪连作土壤拮抗细菌与竹荪菌的互作关系，旨在为竹荪连作障碍的全面解析提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 竹荪连作土壤样

2009年4月，采集福建省南平市顺昌县大历乡竹荪产区连作地块土壤样，采样深度5～15 cm。采样后立即将土壤样带回实验室风干，过2 mm筛，4℃保存备用。

1.1.2 供试竹荪菌株

棘托竹荪89 菌株：由福建农林大学菌草研究所提供。

1.1.3 培养基

采用LB固体培养基分离纯化巨大芽孢杆菌；采用LB液体培养基进行巨大芽孢杆菌发酵培养；采用PDA培养基进行竹荪菌培养及与巨大芽孢杆菌的平板对峙试验。

1.2 方法

1.2.1 竹荪菌拮抗细菌的分离纯化

称取20 g土壤样品，加入盛有100 mL无菌水的三角瓶中（含玻璃珠），l40 r/min振荡20 min，静置。取1 mL上清液，系列稀释至1×l0-9，将梯度稀释好的上清液进行平板涂布，并置于37 ℃培养箱中培养2～3 d，挑取单菌落，平板划线法纯化，纯菌株移入斜面，保存备用。以竹荪菌为指示菌，将分离的细菌菌株采用平板对峙生长法进行拮抗性筛选，选出对竹荪菌生长有抑制作用的菌株，保存备用。

1.2.2 菌株的初步鉴定

将筛选获得的菌株接种在LB培养基上，28℃培养48 h后，观察菌落形态。革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态。对该菌株进行过氧化氢酶反应、甲基红试验、吲哚试验、卵黄试验、淀粉水解、葡萄糖发酵等生理生化试验[9]。

取适量的培养菌落，提取DNA，根据细菌的16S rDNA核苷酸系列引物，进行PCR扩增，测序，并与BLAST进行比对。

1.2.3 拮抗细菌发酵液的制备

将竹荪菌拮抗细菌接种于装有150 mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃ 120 r/min培养24 h后，发酵液于4℃沉淀24 h。一部分发酵液高压灭菌（121℃，0.1 MPa）处理20 min，作为高温处理拮抗细菌发酵液；另一部分用0.22 μm的细菌滤膜去菌体，作为无细胞拮抗细菌发酵液[10-11]。

1.2.4 竹荪菌拮抗细菌发酵液蛋白粗提液的制备

将已活化的竹荪菌拮抗细菌接种于LB液体培养基中，37℃120 r/min培养20 h，4℃ 8 000 r/min离心10 min，取上清液，加入固体硫酸铵至饱和，4℃沉淀24 h，10 000 r/min离心10 min，弃除上清液，取沉淀用5 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 6.0）悬浮[12-13]。

1.2.5 竹荪菌拮抗细菌对竹荪菌丝生长影响的测定

采用平板对峙培养法，用直径为6 mm的打孔器取生长良好的竹荪菌菌块，接入PDA平板一侧，于24 ℃恒温培养箱中培养3 d。取培养后生长良好的竹荪菌，在距竹荪菌块边缘2 cm 处划线接入活化24 h 的竹荪菌拮抗细菌，不接竹荪菌拮抗细菌为对照，3次重复。24℃恒温继续培养，待竹荪菌长到培养皿边缘时，测定抑菌宽度，计算抑菌率（ 抑菌宽度用十字交叉划线法测量）[14]。

抑菌率=[（对照竹荪菌菌落直径-处理竹荪菌菌落直径）/对照竹荪菌菌落直径]×100%[15]

1.2.6 竹荪菌拮抗细菌发酵液对竹荪菌丝生长影响的测定

采用平板对峙培养法，在各PDA平板上分别放置一个无菌的牛津杯，在距离牛津杯2 cm 处接种竹荪菌块（d=6 cm），将竹荪菌拮抗细菌发酵液、过滤除菌发酵液、高温灭菌发酵液各150 μL 分别加入牛津杯中，以牛津杯中加入无菌水作为对照，设置3个重复，于4℃冰箱中放置12 h 后，置24 ℃恒温培养箱中培养，待对照组菌丝长至平板边缘时，测定抑抑菌宽度，计算抑菌率[16]。

1.2.7 竹荪菌拮抗细菌发酵液蛋白粗提液对竹荪菌丝生长的影响

采用平板对峙培养法，在各PDA平板上分别放置一个无菌的牛津杯，在距离牛津杯2 cm 处接种竹荪菌块（d=6 cm），在牛津杯中加入竹荪菌拮抗细菌发酵液的蛋白粗提液150 μL，以牛津杯中加（NH4）2SO4饱和的5 mmol/L磷酸缓冲溶液作为对照，设置3个重复，在4℃冰箱中放置12 h 后，24℃恒温培养，待对照组菌丝长至平板边缘时，测定抑菌宽度，计算抑菌率[17]。

2 结果与分析

2.1 竹荪菌拮抗细菌的鉴定

竹荪菌拮抗细菌的菌落形態为：灰白色，圆形，边缘不规则，干燥，有皱褶，不透明，菌落直径1～2 cm。菌体杆状，革兰氏染色反应阳性。

试验生理生化结果见表1。查阅伯杰细菌鉴定手册（第八版），表明该菌与巨大芽孢杆菌的生理生化特性的描述完全相同。结合菌株形态特征，初步认定该菌株为巨大芽孢杆菌（Bacillus magaterium）。

拮抗细菌16S rDNA的PCR扩增结果如图1所示。图1表明，扩增的16S rDNA条带约为1 500 bp，符合理论预期值。说明该条带具有高专一性，得率高，能用于直接测序，并与BLAST进行比对。同源性分析结果表明，该菌株的16SrDNA 序列与多种Bacillus megaterium的16S rDNA序列相似性高达99%以上，结合该菌形态学和生理生化特性，鉴定该菌株为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，Accession AB697153.1）。

2.2 巨大芽孢杆菌对竹荪菌丝生长的影响

图2表明，巨大芽孢杆菌对竹荪菌丝的生长有明显的抑制作用，接种了巨大芽孢杆菌的PDA平板上的竹荪菌丝长势明显弱于未接种巨大芽孢杆菌的PDA平板，抑制率为58.37%。

2.3 巨大芽孢杆菌发酵液对竹荪菌丝生长的影响

表2可知，未除菌的巨大芽孢杆菌发酵液对竹荪菌丝生长具有明显的抑制作用，抑制率为64.81%，过滤除菌发酵液、高温灭菌发酵液对竹荪菌丝的生长没有明显的抑制作用。

2.4 巨大芽孢杆菌发酵液蛋白粗提液对竹荪菌丝生长的影响

由图3可知，巨大芽孢杆菌发酵液蛋白粗提液对竹荪菌丝的生长有抑制作用，其抑制率达到55.9%。

3 讨论

具有一定的抑真菌作用为自然土壤的重要功能之一，包含非常复杂的作用机制[18]。吴敏娜等[19]认为，土壤抑真菌作用与细菌群落结构存在密切的关系。也有学者认为，土壤中存在可直接分泌抗真菌物质的微生物，或存在能诱导或促进抗真菌微生物产生更多有效物质的种群[20-22]。还有研究认为，影响土壤抑制真菌的因素之一为土壤细菌种群多样性[23]。

已有的研究表明，巨大芽孢杆菌菌株在生物防治方面已发挥重要作用。曹燕鲁等[17]发现，Bacillus megaterium B1301对有害真菌具有拮抗作用。推测土壤中栖息的某些巨大芽孢杆菌菌株可能与土壤抑真菌作用具有密切关系。

本文从竹荪连作地土壤中分离得到一株对竹荪菌生长具有明显抑制作用的菌株，经鉴定为巨大芽孢杆菌。过滤除菌表明，巨大芽孢杆菌代谢产物中粒径小于0.22 μm的小分子物质对竹荪没有明显的抑制作用，未除菌的巨大芽孢杆菌发酵液对竹荪菌丝生长具有明显的抑制作用，发酵液蛋白粗提液对竹荪菌丝的生长也具明显的抑制作用，但对照液也在一定程度上延缓了竹荪的生长，使得竹荪菌丝横向上的生长受到明显的抑制，但在纵向上仍能生长，因此除巨大芽孢杆菌发酵液产生的抑菌蛋白外，其他抑制竹荪菌丝生长的因素还需要进一步验证。

有研究表明，竹荪连作土壤中的微生物区系、土壤物质组成以及酶活力都发生明显变化。种植竹荪初期，新地和连作地细菌总量、真菌总量差异不大，但生长至出菇盛期，连作地细菌总量增幅超过新地，新地真菌总量增幅远远超过连作地，连作使竹荪菌和土壤真菌都受到抑制，结合本实验结果，说明土壤物质组成变化可能促进了土壤巨大芽孢杆菌及其他细菌的生长，抑制了竹荪菌及其他土壤真菌的生长。巨大芽孢杆菌代谢物的累积，尤其是对竹荪生长具有抑制作用的代谢物蛋白质抑制了竹荪的生长。其次，竹荪生长过程中，竹荪菌及其代谢物、土壤微生物及其代谢物共存于种植土壤这个复杂的物质组成体系，随着连作年限的增加，导致土壤微生物群落结构发生变化，影响竹荪菌的生长。这可能都是造成连作障碍现象的原因。

总之，竹荪连作障碍的形成机制复杂，仅从本研究的结果判定土壤巨大芽孢杆菌所产蛋白是造成竹荪连作障碍的主要原因尚不够充分，下一步工作将应用土壤复杂体系未知物非歧视分析技术，使用竹荪生长趋势图分析技术，联系实际生产，研究特征代谢物群对竹荪菌生长的影响。

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