利用体外发酵技术研究锡林郭勒草原不同生长期牧草瘤胃内甲烷产生规律

贾炳玉，李 超，高 民

(1.内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特，010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031)

全球变暖是当前公众关注的热点问题。其中，自然界循环以及人类活动所产生和排放的温室气体(greenhouse gas，GHG)是全球变暖的重要因素。当大气层中有大量的温室气体聚集时，会对大气层的结构产生破坏作用，从而导致辐射到地球表面的太阳光范围和强度增加，最终使得全球的气温升高。

甲烷(CH4)是仅次于二氧化碳(CO2)的第二大温室气体，它对全球温室效应的贡献率为15%～20%[1]。研究表明，尽管甲烷的排放量还远低于CO2，但其致温室效应的潜能远远高于CO2(为23倍～25倍)[2]，另外，由于甲烷具有能长时间存在于大气层之中(约12年)的特点，因此与单位排量CO2相比，其致温室效应贡献率更高。据统计，农业领域的甲烷排放占全球大气层总甲烷排放的52%[3]，而其中畜牧业特别是反刍动物养殖业排放又占绝大多数。在家畜的甲烷排放量中,反刍动物占97%[4]。2010年，我国反刍家畜甲烷排放量为6.60Tg[5](1Tg=1012g)。因此，甲烷气体的排放是对大气和生态环境的严重威胁，其减排排放对减缓温室效应具有重要意义。甲烷也是重要的能量载体物质，其减排对提高营养物质能量利用效率，进而改善饲料营养成分利用效率，提高动物生产性能具有重要意义。降低CH4的排放能够提高能量的利用效果，根据邓代君等[6]，草原上生长的某些天然植物，例如单宁类植物、皂苷类植物和葱属植物等，可以作为天然甲烷菌抑制剂，减少放牧反刍家畜的CH4排放。另外，抑制CH4排放不单单对温室效应的抑制有作用，也有利于家畜对牧草利用率的提高。随着我国的高速发展，环境问题发展中面对的一个大问题，草原植被的保护与恢复重建、退耕还草、草地承载力与家畜配置等项目也是现在研究的热点，找到一个草原放牧与环境保护的平衡点，对于低碳型畜牧业的发展具有重要意义。目前国外牧草体外发酵研究较多，如Scehovie[7]以天然牧场各种牧草的浸提液与瘤胃液在体外瘤胃模拟装置中进行培养，以产气量作为指标，研究了不同植物种类对瘤胃微生物种群活性的影响。近几年国内也有相关研究报道，郭彦军等[8]利用体外产气法测定高山牧草和灌木的干物质降解率，发现12 h的产气量与48 h的干物质降解率之间呈正相关关系，产气量与缩合单宁含量呈负相关关系。

本试验以锡林郭勒盟毛登牧场为例，通过采集牧草进行体外发酵试验测定其瘤胃内甲烷产量，为准确估测放牧绵羊CH4排放提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 牧草样品的采集 2016年7、8、9三个月份采集锡盟毛登牧场的牧草，每个月采集一次牧草，每次采集10个1 m2的样方，样方在一条直线上，间隔20 m。采集后带回实验室105 ℃烘干，粉碎，得到混合牧草样品。四种优势品种牧草(羊草、隐子草、苔草、针茅)分别采集1 kg，带回实验室105 ℃烘干，粉碎，得到单一牧草样品。

1.1.2 人工瘤胃培养液的制备 选择2只健康、体重(25.0±2.0)kg 的成年湘东黑山羊，安装永久性瘤胃瘘管，作为瘤胃液供体动物，单笼饲养。饲粮精粗比为40:60，精饲料组成为玉米47.00%，豆粕24.00%，麦麸22.00%，食盐0.77%，石粉2.23%，预混料4.00%。粗饲料为玉米秸秆，整个试验期内，每只瘘管羊每天饲喂精饲料200 g，粗饲料300 g，自由饮水。每天08:30和18:00分2次等量饲喂。晨饲前1 h通过瘘管采集新鲜瘤胃液，迅速装入保温瓶带回实验室。参照Menke等[9]的瘤胃营养液的配制方法，配制2 400 mL瘤胃营养液，备用。将采集到的瘤胃液迅速用6层脱脂纱布准确过滤出600 mL，加入到提前准备好的2 400 mL营养液中，配制成混合人工瘤胃培养液，利用磁力搅拌仪搅拌均匀，整个过程保持39.5 ℃进行并始终通入CO2以保持厌氧环境。

1.1.3 体外模拟瘤胃发酵设备 本试验采用全自动体外模拟瘤胃发酵设备[10]。该设备包括恒温培养箱、厌氧发酵瓶、压力传感器、三通电磁阀、计算机和安捷伦气相色谱仪。培养箱设定振荡频率为50 r/min，培养温度为39.5 ℃；厌氧瓶放入恒温培养箱内部，通过胶皮导管与压力传感器和三通电磁阀相连接。发酵开始后，可实时记录厌氧发酵瓶中的压力，并通过压力与气体体积间的关系计算厌氧发酵瓶中的气体生成量。当厌氧发酵瓶中的压力超过9 kPa时，计算机控制三通电磁阀打开，厌氧发酵瓶中的气体被释放，气体通过气体导管进入气相色谱仪(安捷伦7890A，美国)，测定氢气(甲烷)产量根据厌氧瓶顶部空间大小、压力与气体体积的转化系数和氢气(甲烷)含量进行计算[11]。

1.2 试验方法

将牧草按照不同种类分为五组，一种混合牧草，四种单一优势牧草，烘干，粉碎。每个组1个平行，重复3次。称取0.6 g底物加入到145 mL的厌氧发酵瓶中，置于39.5 ℃恒温培养箱中预热，抽取60 mL配制好的人工瘤胃培养液加入发酵瓶中，加入培养液的同时向厌氧发酵瓶中通入CO2以保证发酵瓶中为厌氧环境，将发酵瓶放入体外发酵设备，连接压力传感器，体外发酵开始。

1.2.1 体外发酵指标的测定

1.2.1.1 干物质消失率的测定 进行体外发酵48 h，终止后，采用Tilley等[12]的方法计算干物质消失率。

1.2.1.2 VFA的测定 挥发性脂肪酸(VFA)的浓度测定，参照秦为琳[13]的方法。在48 h体外发酵终止后，取发酵液2 mL，15 000 rpm、4 ℃条件下离心8 min(德国Eppendorf公司)，吸取上清液1.5 mL，加入0.15 mL、25%的偏磷酸溶液固定VFA，静置15 min后利用气相色谱仪(安捷伦7890A)测定VFA含量和组成。

1.2.1.3 甲烷含量和甲烷产量的测定 甲烷含量可直接通过气相色谱仪测定。甲烷产量根据甲烷含量、厌氧发酵瓶顶部空间大小和压力进行计算[11]。

应用非线性软件程序(NLREG)，按照Wang[14]提出的模型对体外发酵产气曲线进行拟合。

1.3 数据统计分析

数据用Excel初步记录并做简单处理，然后用SPSS 21软件对数据进行处理，利用一般线性模型(GLM)程序和Duncan氏法多重比较，使用正交多项比较(orthogonal polynomial contrast)分析各个指标变化的趋势。

2 结果与分析

2.1 牧草产气量

当48 h体外发酵停止后得到三个月(7、8、9)产气量数据，产气量连续记录48 h，每间隔1 h计算累积产气量。从表1可知，不同生长期牧草体外发酵产气量随发酵时间延长逐渐增加，在前期迅速增加，36 h后增长速率变慢，最后趋于平缓。导致这一现象的原因可能是在后期培养过程中，代谢产物累积导致发酵瓶中的pH下降，抑制瘤胃微生物发酵或者微生物大量死亡，使得剩余的底物发酵不完全[15]。也有可能是因为发酵时间接近结束，能够发酵的底物减少导致。相同月份的不同品种牧草间比较，羊草的产气量高于其他牧草，针茅的产气量比较少。不同月份的同一品种牧草比较，随着月份增加，产气量下降。

表1 不同生长期牧草体外发酵产气量Table 1 In vitro fermentation of herbage in different growth stages

2.2 甲烷产量

由表2可见， 8、9两个月份甲烷产量与7月份相比，下降差异显著(P<0.05)。9月份氢气产量与7、8月份相比产量增多，有显著差异。从氢的代谢角度讲，产氢微生物是瘤胃中氢的主要生成者。牧草(纤维类植物)的降解是产生氢的重要途径，纤维分解菌在瘤胃生态系统中发挥中枢作用，大多数纤维分解菌的主要代谢终产物为氢。

甲烷生成的抑制会引起氢的积累，抑制细菌细胞内氧化还原过程中辅酶的再氧化，最终抑制纤维降解 。产甲烷菌是主要耗氢微生物，利用瘤胃内其他微生物产生的发酵终产物，尤其是氢作为底物产生甲烷，甲烷菌被抑制后往往会出现氢的累积[16]。从表2和表3中看出，随着时间推移甲烷产量降低，氢的产量增加，结论与上述研究相符。随着月份增加，牧草的甲烷产量都呈现下降趋势。氢气产量呈现上升趋势，和前面所得到的结果一直，符合甲烷产量降低，氢的产量增加的趋势。

2.3 干物质消失率

干物质消失率(IVDMD)是体外发酵技术评定日粮底物被瘤胃微生物消化利用程度的最基础指标。刘树军[17]对不同饲草的体外发酵研究中发现，不同牧草发酵程度不同，虽然玉米青贮和国产苜蓿干草的IVDMD差异不显著，但两者IVDMD显著高于其他牧草。本试验中，48 h体外发酵终止后，计算出干物质消失率。其中羊草的平均干物质消失率最高，针茅的平均干物质消失率最低。从图1中可看出，7月干物质消失率明显高于8、9两个月，说明7月底物更容易被瘤胃微生物降解，随着牧草的生长成熟，纤维化程度越来越高，品质下降，干物质消失率呈现下降趋势。同时表明干物质消失率高，甲烷产量也随之升高。

表2 不同月份混合牧草体外瘤胃发酵甲烷、氢气含量及产量Table 2 The methane, hydrogen content and yield of mixed pasture in different months in vitro

表3 优势品种牧草类生长月份甲烷、氢气产量Table 3 The methane, hydrogen content and yield of dominant species forage in growing month

2.4 挥发性脂肪酸的测定

挥发性脂肪酸(VFA)中的乙酸、丙酸和丁酸对动物体代谢作用最为重要，大约占瘤胃总VFA产量的95%[18]。可为动物提供能量，同时也是合成体脂肪和乳脂肪的原料。由表4可见，随着月份增加，混合牧草的乙酸产量、丙酸产量和乙酸/丙酸比值都呈现下降趋势，特别是9月和7月相比，差异显著(P<0.05)。这一结果与韩继福等[19]的研究相符合，CH4产量与乙酸产量、丙酸产量、和乙酸/丙酸比值均呈正相关。由表5可见,单一牧草的乙酸产量、丙酸产量和乙酸/丙酸比值变化情况，得出随着月份增加，牧草中羊草、针茅乙酸产量、丙酸产量和乙酸/丙酸比值下降明显，甲烷产量也都随之下降，符合正常变化规律。苔草、隐子草则相反，随着生长时间加长，乙酸产量、丙酸产量和乙酸/丙酸比值反而增加，但是甲烷产量则呈下降变化，原因可能是因为氢气的积累，抑制甲烷的生成，符合前文所说的情况。

图1 不同生长期干物质消失率变化Fig.1 Change of dry matter disappearance rate indifferent growing stages

表4 混合牧草产生VFA浓度变化Table 4 VFA concentration variation of mixed pasture

3 小 结

本试验通过体外发酵测定锡林郭勒盟毛登牧场牧草(一种混合牧草，四种单一优势牧草)生长期的甲烷、氢气产量及总产气量变化，以及挥发性脂肪酸和干物质消失率的变化，发现：随着牧草生长期的加长，牧草总产气量呈现下降趋势，8、9两个月甲烷产量较7月下降且差异显著(P<0.05)，9月份氢气产量与7、8月份相比产量增多；随着月份的增加，牧草平均干物质消失率呈现下降趋势，其中羊草的平均干物质消失率最高，针茅的平均干物质消失率最低；并且，随着月份的增加，牧草中挥发性脂肪酸乙酸和丙酸以及乙酸/丙酸比值均呈现下降趋势，与甲烷产量呈正相关。

表5 优势品种牧草类生长月份总VFA产量变化Table 5 Variation of total VFA yield for dominant species of forage species

参考文献：

[1] DE VISSCHER A,VAN CLEEMPUT O. Simulation model for gas diffusion and methane oxidation in landfill cover soils[J].Waste Management,2003,23(7):581-591.

[2] CLIMATE CHANGE: The Scientific Basis: Contribution of Working Group I to the Third Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change[M].Cambridge University Press,UK,2001.

[3] SMITH P,MARTINO D,CAI Z,et al. Greenhouse gas mitigation in agriculture[J]. Biological Science,2008, 363(1492): 789-813.

[4] 程胜利,肖玉萍,杨保平,等.反刍动物甲烷排放现状及调控技术研究进展[J],中国草食动物科学,2013,33(5):56-59.

[5] 王荣,邓近平,王敏,王玉诗,张玉茹,颜志成,谭支良. 基于IPCC Tier 1层级的中国反刍家畜胃肠道甲烷排放格局变化分析[J]. 生态学报,2015,35(21):7 244-7 254.

[6] 邓代君,王金合,杜晋平,等. 植物提取物对瘤胃发酵的调控作用[J]. 饲料工业,2009,30(8):5-6.

[7] SCEHOVIC J. In vitro measurement of rumen microbial activity in the presence of extracts from natural grassland spieces[J].Forages,1998,154:249-260.

[8] 郭彦军,龙瑞军,张德罡,等. 利用体外产气法测定高山牧草和灌木的干物质降解率[J]. 草业学报,2003,12(2):54-60.

[9] MENKE K H,RAAB L,SALEWSKI A,et al. The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding stuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro[J]. The Journal of Agricultural Science，1979, 93(1):217-222.

[10] MUETZEL S,HUNT C L,TAVENDALE M H. Brief communication: evaluating rumen fluid from sheep and cattle as inoculum in a newly developed automated in vitro rumen batch culture system[J]. Proceeding of the New Zealand Society of Animal Production,2011,71:240-242.

[11] WANG M，TANG S X，TAN Z L，et al. A mathematical model to describe in vitro kinetics of H2 gas accumulation[J]. Animal Feed Science and Technology,2013,184:1-16.

[12] TILLEY，J M A，TERRY R A. A two-period technique for the in vitro digestion of forage crops[J]. Grass and Forage Science,1963,18(2):104-111.

[13] 秦为琳. 应用气相色谱测定瘤胃挥发性脂肪酸方法的研究改进[J]. 南京农业大学学报,1982,5(4):110-116.

[14] WANG M，TANG S X，TAN Z L，et al. Modeling in vitro gas production kinetics: Derivation of Logistic-Exponential(LE)equations and comparison of models[J]. Animal Feed Science and Technology,2011,165(3-4):137-150.

[15] 余苗. 不同生长期两种牧草瘤胃降解率及体外发酵产气特性的研究[D].长沙:湖南农业大学,2013.

[16] 韩如旸,闵航,陈美慈,赵宇华. 嗜热厌氧纤维素降解细菌的分离、鉴定及其系统发育分析[J]. 微生物学报,2002,42(2):138-144.

[17] 刘树军．不同饲草的体外发酵甲烷产生量研究[D]. 北京:中国农业科学院,2011.

[18] 李旺.瘤胃挥发性脂肪酸的作用及影响因素[J]. 中国畜牧杂志,2012,48(7):63-66.

[19] 韩继福,冯仰廉,张晓明,等.阉牛不同日粮的纤维消化、瘤胃内VFA对甲烷产生量的影响[J].中国兽医学报,1997,17(3):278-280.