沙门氏菌马流产凝集试验抗原参考品的研制

彭国瑞，魏财文，张 媛，王秀丽，李 建，辛凌翔，张一帜，彭小兵，李俊平

（中国兽医药品监察所，北京 100081）

马流产沙门氏菌病是由马流产沙门氏菌（Salmonella abortus equi）引起的一种以怀孕马属动物流产为特征的传染病，能引起地方性流行。初产母马和幼驹对其最易感，幼驹感染后多呈败血症或局部炎症，公畜则为睾丸炎或鬐甲瘘。易感性马群一旦传入此病，则可引起母马暴发性大批流产。目前，对该病的诊断常采用沙门氏菌马流产凝集试验。我国农业行业标准和出入境检验检疫行业标准对这一方法均做了规范，其中抗原、阳性血清和阴性血清是沙门氏菌马流产凝集试验的关键性物质。为保证诊断试剂的质量，确保诊断结果的准确性和稳定性，《中华人民共和国兽药典》（2015年版）和《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）规定，这几种试剂的半成品和成品检验需使用沙门氏菌马流产凝集试验抗原参考品。

本研究按照2015年版《兽药典》和2000年版《兽用生物制品规程》有关规定，结合以往各批次沙门氏菌马流产凝集试验抗原参考品的制备标定报告及实践，进一步提高了该参考品的制备、标定和检验标准，完成了多批次参考品的制备，同时对参考品的保存期内稳定性进行了监测，并将其应用于实际生产和检验。

1 材料

1.1 菌种

马流产沙门氏菌C77-1株（CVCC79001）：由中国兽医药品监察所制备、鉴定和保管。

1.2 血清、培养基及试剂

效价 1∶1 600、1∶3 200 和 1∶6 400 沙门氏菌马流产凝集试验阳性血清参考品（简称阳性血清参考品，批号200601）、阴性血清参考品（简称阴性血清，批号201301）和沙门氏菌马流产凝集试验抗原参考品（简称抗原参考品，批号201101）：由中国兽医药品监察所制备和标定；沙门氏菌属因子血清O4和H-enx：购自丹麦国立血清中心。普通琼脂、普通肉汤、TG和TSB等培养基：购自北京中海生物科技有限公司。其他试剂为国产分析纯。

1.3 其他

细菌比浊标准管：由中国食品药品检定研究院提供。

2 方法

2.1 生产用菌种制备

开启马流产沙门氏菌C77-1株冻干菌种，接种普通肉汤，37 ℃培养24 h；划线接种普通琼脂平板，37 ℃培养24 h；选择典型光滑菌落移植于普通琼脂斜面，37 ℃培养24 h。

2.2 生产用菌种鉴定

（1）一般形态学和生化特性检查；（2）用沙门氏菌属因子血清O4和H-enx进行平板凝集试验，检查生产菌种的血清学特性；（3）用玻片凝集方法在1∶500吖啶黄溶液中进行变异检查；（4）用生理盐水和1∶200倍稀释的标准阴性血清参考品进行试管凝集试验[1]。

2.3 抗原制备

将检验合格的种子转接普通琼脂，进行扩大培养；用生理盐水将菌苔洗下，收集于带有玻璃珠的瓶中，摇碎菌块，用灭菌纱布漏斗过滤；按总体积的1%加入甲醛溶液，37 ℃灭活48 h后，接种普通肉汤和普通琼脂进行无菌检验。

2.4 抗原浓度检定

对检验合格的抗原充分振摇后，取部分抗原用含1%甲醛溶液的生理盐水作适当比例稀释，每个稀释度取6.0 mL，通过标准比色卡与1.0×1010CFU/mL标准细菌比浊管比较，直至与细菌比浊标准管一致，根据最终稀释倍数计数抗原浓度。

2.5 抗原配制

用含1 %甲醛溶液的生理盐水调整抗原浓度至2.0×1011CFU/mL，按10 mL/瓶分装，加盖密封，

2～8 ℃保存。

2.6 抗原检验

2.6.1 性状、无菌检验和装量检查 依据2015年版《兽药典》进行[2]。

2.6.2 效价测定 将效价为1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400的阳性血清参考品及阴性血清参考品，分别稀释到 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400……1∶6 400稀释度。取各稀释度血清2.0 mL，分装于2支试管，每支1.0 mL，组成2列。一列中，每管加入1∶20稀释的新制抗原1.0 mL，另一列每管加入1∶20稀释的抗原参考品1.0 mL。另在2支仅加1.0 mL生理盐水的试管，分别加入1∶20稀释的新制抗原和抗原参考品作为对照，观察是否有自凝现象。将各组试管振摇混匀，37 ℃反应20 h后，室温静置2 h，进行观察，按最终稀释度记录结果。2.7 稳定性监测

对 2～8 ℃条件下保存1、1.5、2和2.5年的抗原按照2.6的方法进行检验[3]。

3 结果

3.1 生产用菌种制备及鉴定

经鉴定，该菌种为革兰氏阴性小杆菌，其生化特性符合沙门氏菌属特性，血清学特性检查及变异检查均合格（表1）。

表1 血清型特性和变异检查结果

3.2 抗原制备

该菌在普通琼脂上纯粹生长，收获的灭活菌液在普通肉汤和普通琼脂中无菌生长。

3.3 抗原浓度检定

抗原原液稀释至35倍时与细菌比浊标准管一致，即抗原浓度为3.5×1011CFU/mL。

3.4 抗原检验

3.4.1 性状 本品为均匀混悬液，静置后，底部有少量沉淀。

3.4.2 无菌检验 抗原接种培养基后均无菌生长，

无菌检验合格（表2）。

表2 无菌检验结果

3.4.3 装量检查 随机抽取5瓶，装量均不低于10 mL。

3.4.4 效价测定 按照2015年版《兽药典》马流产沙门氏菌凝集试验抗原、阳性血清和阴性血清附注“凝集反应的判定标准”观察记录结果。被检抗原和抗原参考品与3份阳性血清参考品的凝集价均一致，且与阳性血清参考品的原凝集价一致，与1∶200稀释的阴性血清均不发生凝集，并在生理盐水对照管中无自凝现象（表3）。

表3 抗原效价测定结果

3.5 保存期间稳定性监测

在监测期内该抗原检验结果同3.4，性质稳定。

4 讨论与结论

利用沙门氏菌马流产凝集试验对沙门氏菌引起的马流产进行诊断[4-5]，是目前最为常用的血清学方法之一，其他诸如LAMP[6]、PCR等核酸检测方法目前尚未得到推广。沙门氏菌马流产凝集试验所用抗原、阳性血清和阴性血清等试剂的质量直接关系到诊断结果的准确性和稳定性，因此建立沙门氏菌马流产凝集试验国家参考品，对于该诊断制品的质量控制具有重要意义。

用本文所述方法制备并用3种效价阳性参考血清标定的沙门氏菌马流产凝集试验抗原参考品，较用2种效价血清标定的抗原效价更为准确，在性状、无菌检验及效价测定等方面符合2015年版《兽药典》和2000年版《兽用生物制品规程》中关于沙门氏菌马流产凝集试验抗原制备、标定和检验的规定。该参考品性质稳定、品质良好，能够满足沙门氏菌马流产凝集试验阳性血清和阴性血清参考品的标定及沙门氏菌马流产凝集试验抗原、阳性血清和阴性血清的成品、半成品检验的实际生产和使用要求，可以作为抗原参考品用于兽用生物制品国家标准物质。

[1] 农业部兽用生物制品规程委员会. 中华人民共和兽用生物制品规程（2000年版）[A]. 北京：农业部，2000.

[2] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典：2015年版，三部[M]. 北京：中国农业出版社，2016.

[3] 康凯. 马流产凝集抗原及冻干阳性血清的保存期试验[J]. 中国兽药杂志，1996（3）：32-34.

[4] 农业部. 马流产沙门氏菌病诊断技术：NY/T 570-2002[S]. 北京：农业部，2002.

[5] 国家质量监督检验检疫总局. 马流产沙门氏菌病凝集试验方法：SN/T 1382-2004[S]. 北京：国家质量监督检验检疫总局，2004.

[6] 王福厚，张进隆，刘根新，等. 环介导恒温扩增（LAMP）-检测沙门氏菌[J]. 中国动物检疫，2011，28（5）：44-46.