芍药苷对高糖刺激的小鼠骨髓来源的巨噬细胞TLR4信号通路的影响

杨雯雯，段分分，邵云侠，王 坤， 吴永贵

随着糖尿病发病率的上升，糖尿病肾病已成为全球终末期肾病的主要原因之一。从实验和临床研究中获得的证据表明，肾脏炎症在糖尿病期间肾脏损伤的进展中起关键作用[1]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在糖尿病肾病中的作用机制已相当明确,Lin et al[2]发现在糖尿病肾病患者的肾活检中TLR4表达升高，与之相关的肾组织中巨噬细胞的浸润程度也随之增加。白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)是我国重要传统中药白芍根的主要成分。前期研究[3-4]表明TGP可以抑制STZ诱导的糖尿病肾组织巨噬细胞激活，其机制部分与抑制肾组织中巨噬细胞的TLR4及STAT3信号通路有关。TLR4可以通过髓样分化因子 88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)依赖途径和MyD88非依赖途径激活下游信号通路，参与核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)的活化[5]。而芍药苷(paeoniflorin, PF)作为TGP的主要有效成分，一直深受广泛关注。该研究旨在探讨PF是否通过TLR4信号通路抑制巨噬细胞的激活，为糖尿病肾病提供新的防治思路。

1 材料与方法

1.1材料6～8周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠和TLR4-/-小鼠(南京大学模式动物研究所)；PF(南京广润公司)；CCK-8检测试剂盒(南京诺唯赞公司)；兔抗TLR4、TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，Trif)、MyD88、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)抗体(美国Abcam公司)；兔抗磷酸化白介素-1受体相关激酶(phospho-IL-1 receptor-associated kinase-1，p-IRAK1)、磷酸化干扰素调节因子3(phospho-interferon regulatory factor 3,p-IRF3)、NF-κBp65、NF-κBp-p65抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；小鼠抗β-actin抗体、山羊抗兔IgG抗体、山羊抗小鼠IgG抗体(武汉三鹰公司)；TNF-α、IL-1β和MCP-1 ELISA检测试剂盒(美国R&D Systems公司)；LeicaTCS SP5共聚焦扫描显微镜(德国Leica公司)。

1.2研究方法

1.2.1提取骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)及鉴定 处死小鼠后，分离股骨和胫骨，在超净工作台中剪断骨的两端，用含有2%胎牛血清的无菌PBS溶液冲洗骨髓腔细胞，离心后弃去上清液，用配制好的DMEM培养基轻轻吹打重悬细胞，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养；7 d后收集细胞，用巨噬细胞表面抗原F4/80和CD11b抗体标记细胞，鉴定巨噬细胞的纯度和成熟度。

1.2.2优化实验条件 使用不用浓度的葡萄糖刺激BMDMs，同时不同浓度的甘露醇补充入各刺激组，以排除高糖产生的渗透压对实验的影响[5]。然后收集细胞，提取总蛋白，选取TLR4和iNOS蛋白表达最高时的糖浓度，作为实验的刺激浓度；在确定刺激浓度后，选取不同刺激时间收集BMDMs，以确定高糖刺激的最佳时间。最后采用不同浓度的PF干预高糖刺激的BMDMs，选择抑制蛋白表达上调的最适PF浓度。将BMDMs分为7组：正常糖对照组(LG组)、正常糖对照+PF组(LG+PF组)、高糖刺激组(HG组)、高糖刺激+PF组(HG+PF组)、TLR4-/-对照组(TLR4-/-组)、TLR4-/-对照+高糖刺激组(TLR4-/-+HG组)、TLR4-/-对照+高糖刺激+PF组(TLR4-/-+HG+PF组)。

1.2.3PF干预及高糖刺激对巨噬细胞活力的影响 将BMDMs制成细胞悬液接种于96孔板中，设无细胞组、无药物对照组、空白对照组、不同浓度PF的高糖刺激组，24 h后每孔加入CCK-8溶液，用酶标仪进行光密度(optical density，OD)值测定，算出细胞活力。

1.2.4PF干预对高糖刺激的巨噬细胞迁徙能力的影响 将BMDMs接种于Transwell小室中，按照实验分组，每组分别加入高糖刺激和PF干预，后在各组的Transwell下室中分别加入重组小鼠MCP-1培养后弃取上清液，Transwell上室乙醇固定20 min后，切去底部薄膜，结晶紫染色，轻轻铺在载玻片上，显微镜下拍照后用PBS漂洗2次，薄膜置于33%冰醋酸中，回收结晶紫染色液，测定各组OD值后比较分析。

1.2.5实时荧光定量PCR法测定各分组细胞中的TNF-α、IL-1β、MCP-1及iNOS的mRNA的转录表达 提取每组BMDMs的总RNA后，立即检测其纯度，并反转录成cDNA。引物序列见表1。SYBR Green PCR 试剂盒被用来进行 PCR，基因的相对GAPDH表达采用 2-ΔΔCt法分析。

表1 各引物序列

1.2.6Western blot法检测各组巨噬细胞的蛋白表达 提取各组细胞的总蛋白后，测定浓度。加样后经电泳，转膜，脱脂牛奶室温封闭后，TBST洗膜3次，将膜放入一抗TLR4(1 ∶500)、MyD88(1 ∶100)、Trif(1 ∶1 000)、p-IRAK1(1 ∶200)、p-IRF3(1 ∶1 000)、IRF3(1 ∶1 000)、NF-κBp65(1 ∶1 000)、NF-κBp-p65(1 ∶1 000)、iNOS(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶35 000) 中4 ℃过夜，TBST洗膜3次，二抗室温下孵育45 min后，再次洗膜3次，最后用ECL发光试剂盒进行显影，Image J软件对条带进行分析。

1.2.7ELISA法检测各组巨噬细胞的培养上清液中细胞因子的分泌量 实验结束后收集各组培养上清液，离心，用ELISA试剂盒检测各组BMDMs培养上清液中TNF-α、IL-1β 和MCP-1的含量。

1.2.8激光共聚焦显微镜分析各组巨噬细胞TLR4和iNOS的协同表达 细胞接种于Petri皿中，固定10 min后，PBS漂洗3次, 每次5 min, 5%驴血清封闭0.5 h，PBS再次漂洗3次，加入抗TLR4和抗iNOS抗体，4 ℃条件下孵育过夜，PBS漂洗3次，加入相应的荧光二抗，室温下避光孵育2 h。再次PBS漂洗，DAPI染核10 min，PBS漂洗后进行封片，最后用激光共聚焦显微镜拍照。

2 结果

2.1BMDMs纯度及成熟度的鉴定流式细胞术鉴定结果显示FITC及CD11b双标的BMDMs达93.5%。见图1。

图1 检测BMDMs纯度及成熟度

2.2实验条件的优化Western blot检测显示，高糖可导致TLR4表达上调，巨噬细胞活化；同时甘露醇作为高糖的渗透压对照，对TLR4的表达及巨噬细胞的活化没有影响。高糖浓度在30 mmol/L时，TLR4表达增加最明显(0.55±0.01,F=379.480,P<0.01),iNOS表达也增加最明显(0.37±0.01,F=283.612,P<0.01)；高糖刺激的BMDMs在1 h TLR4开始过量表达，6 h开始巨噬细胞活化，产生iNOS, 与初始0 h比较:TLR4(1.1±0.002)和iNOS(0.82±0.02)均在24 h达到峰值(FTLR4=420.112,FiNOS=126.858,P<0.01)；PF可以抑制TLR4表达及BMDMs的激活，并且抑制的程度与其剂量有关，在PF浓度为10-5mol/L时，TLR4(0.50±0.03)和iNOS(0.27±0.01)的表达抑制最为明显(FTLR4=291.643,FiNOS=1818,P<0.01)。见图2～4。

2.3PF干预及高糖刺激对巨噬细胞活力的影响高糖刺激对BMDMs活性无影响，PF浓度为10-3mol/L时对高糖刺激的BMDMs活性有影响(95.30±1.56，F=1.083,P<0.01)。见图5。

2.4PF干预对高糖刺激巨噬细胞迁徙能力的影响高糖刺激可以增加MCP-1对巨噬细胞的趋化，导致巨噬细胞迁徙，而PF干预和TLR4基因敲除均可抑制高糖的刺激作用，各组间差异有统计学意义(F=49.39,P<0.01)。见图6。

图2 Western blot检测高糖刺激BMDMs的TLR4及iNOS蛋白表达变化与正常糖浓度组(高糖5 mmol/L)比较：*P<0.05,**P<0.01

图3 Western blot检测高糖刺激BMDMs不同时间点TLR4及iNOS的蛋白表达变化与0 h比较：*P<0.05,**P<0.01

图4 Western blot检测不同浓度PF干预高糖刺激BMDMs对TLR4及iNOS的蛋白表达变化

A: LG组；B: HG组；C: HG+10-8mol/L组；D: HG+10-7mol/L组；E: HG+10-6mol/L组；F: HG+10-5mol/L组；G: HG+10-4mol/L组；与LG组比较：**P<0.01；与HG组比较：##P<0.01

图5 PF对高糖刺激的BMDMs活性的影响

A: LG组；B: HG组；C: HG+10-8mol/L组；D: HG+10-7mol/L组；E: HG+10-6mol/L组；F: HG+10-5mol/L组；G: HG+10-4mol/L组；H: HG+10-3mol/L组；与HG组比较：*P<0.05

2.5实时荧光定量PCR检测各组巨噬细胞的iNOS、TNF-α、IL-1β和MCP-1mRNA的表达与LG组比较，LG+PF组iNOS、TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA的表达差异无统计学意义，HG组的mRNA转录表达明显增加(P<0.01),正常糖浓度下敲除TLR4组的mRNA表达明显减少(P<0.05,P<0.01)；与HG组比较，PF组和TLR4-/-+HG组mRNA表达明显下降(P<0.01)；与TLR4-/-+HG组比较，敲除TLR4之后，PF仍然可以进一步抑制高糖导致的mRNA转录表达的增加(P<0.01),各指标组间差异有统计学意义(FiNOS=297.8、FTNF-α=162.8、FIL-1β=170.9、FMCP-1=102.2，P<0.01)。见图7。

2.6Westernblot检测各组巨噬细胞的iNOS、TLR4、MyD88、p-IRAK-1、Trif、p-IRF3、NF-κBp65和NF-κBp-p65蛋白表达与LG组比较，LG+PF组iNOS、TLR4、MyD88、p-IRAK-1、Trif、p-IRF3、NF-κBp65和NF-κBp-p65的蛋白表达差异无统计学意义，HG组各蛋白表达明显上调(P<0.01)，在正常糖浓度下，TLR4-/-组各蛋白的表达明显减少；与HG组比较，PF干预组和TLR4-/-+HG组的蛋白相对表达量受到抑制(P<0.01)；与TLR4-/-+HG组比较，TLR4-/-+HG+PF组在敲除TLR4基础上，PF仍可以进一步抑制高糖导致的各蛋白表达增加(P<0.01)。各指标每组间差异有统计学意义(FTLR4=227.3、FiNOS=112.99、FMyD88=55.89、Fp-IRAK-1=16.75、FTrif=32.75、Fp-IRF3=42.11、FNF-κBp65=37.92、FNF-κBp-p65=343.9，P<0.01)。见图8。

2.7ELISA检测各组巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-1β和MCP-1水平与LG组比较，LG+PF组细胞培养基上清中所含TNF-α、IL-1β 和MCP-1水平差异无统计学意义，HG组明显增高(P<0.01)，TLR4-/-明显减少(P<0.05,P<0.01)；与HG组比较，HG+PF组和HG+TLR4-/-组明显减少(P<0.01)；与HG+TLR4-/-组比较，敲除TLR4基因后，PF仍可进一步抑制高糖刺激导致的培养基中TNF-α、IL-1β 及MCP-1分泌增加(P<0.01)。每种指标各组间差异具有统计学意义(FTNF-α=29.76、FIL-1β=60.96、FMCP-1=41.65，P<0.01)。见图9。

图6 PF干预对高糖刺激巨噬细胞迁徙能力的影响 ×400

A: LG组；B: LG+PF组；C: HG组；D: HG+PF组；E: TLR4-/-组；F: TLR4-/-+HG组；G: TLR4-/-+HG+PF组；与LG组比较：**P<0.01；与HG组比较：##P<0.01；与TLR4-/-+HG组比较：ΔΔP<0.01

图7 实时定量PCR检测高糖刺激对各组巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA表达

1: LG组；2: LG+PF组；3: HG组；4: HG+PF组；5: TLR4-/-组；6: TLR4-/-+HG组；7: TLR4-/-+HG+PF组；与LG组比较：**P<0.01；与HG组比较：##P<0.01；与TLR4-/-+HG组比较：ΔΔP<0.01

图8 Western blot检测各组巨噬细胞的蛋白表达

A:TLR4、iNOS、MyD88、p-IRAK1、Trif、p-IRF3蛋白相对表达量，B:NF-κBp65和NF-κBp-p65的蛋白相对表达；1:LG组；2: LG+PF组；3: HG组；4: HG+PF组；5: TLR4-/-组；6: TLR4-/-+HG组；7: TLR4-/-+HG+PF组；与LG组比较：**P<0.01；与HG组比较：##P<0.01；与TLR4-/-+HG组比较：ΔΔP<0.01

图9 ELISA法检测各组巨噬细胞培养基中分泌的TNF-α、IL-1β 和MCP-1表达

1: LG组；2: LG+PF组；3: HG组；4: HG+PF组；5: TLR4-/-组；6: TLR4-/-+HG组；7: TLR4-/-+HG+PF组；与LG组比较：*P<0.05,**P<0.01；与HG组比较：##P<0.01；与TLR4-/-+HG组比较：ΔΔP<0.01

2.8共聚焦显微镜分析各组巨噬细胞TLR4和iNOS的荧光表达与LG组细胞比较，LG+PF组绿色及红色荧光表达无差别，TLR4-/-组红、绿荧光基本无表达，HG组荧光表达增强；与HG组比较，HG+PF组、HG+TLR4-/-组、HG+TLR4-/-+PF组荧光表达降低，提示高糖可同时激活TLR4和iNOS在巨噬细胞胞质内表达，PF干预及TLR4基因敲除可抑制高糖的诱导作用。见图10。

3 讨论

糖尿病肾病与全身炎症和局部的肾脏炎症都有关，在糖尿病肾病的早期阶段血清或外周血细胞中可检测到炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1及MCP-1)和免疫介质水平的升高，其中一些因子随疾病进展而增加[6]。本实验的刺激因素是高血糖，同时高血糖也是糖尿病肾病发生的先决条件，巨噬细胞是糖尿病肾脏中发现的最普遍的浸润性白细胞，有研究[7-9]表明，高糖可以刺激巨噬细胞迁移，本实验使用MCP-1作为初始趋化因子，在高糖的刺激下，各组实验细胞均发生了趋化迁移，但与正常糖浓度对照组比较，高糖刺激组巨噬细胞迁移明显增加，其增加的程度可被PF干预及TLR4信号通路敲除抑制。

图10 共聚焦显微镜下各组巨噬细胞TLR4和iNOS的协同表达 ×400

Toll样受体能识别危险相关分子模式的受体并促进先天性免疫反应，可通过两种途径激活下游信号分子：MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径。这两种途径均可参与由TLR4激活的通路从而产生炎症因子[10-11]。在未刺激的细胞中，NF-κB游离存在于胞质中；一旦受到刺激，NF-κB便移位于细胞核中并促进多种炎症因子，如TNFα、IL-1β及MCP-1的释放[12]。在本实验中，高糖作为刺激因素，模拟了糖尿病的微环境，结果提示，在高糖刺激下，TLR4与高糖结合，作为内源性配体，激活下游的依赖MyD88信号途径和非依赖MyD88信号途径，使TLR4、MyD88、p-IRAK-1、Trif、p-IRF3、NF-κBp65及NF-κBp-p65表达均上调，与此同时启动巨噬细胞的活化；表现为巨噬细胞活化产物iNOS，TNF-α、IL-1β及MCP-1的mRNA表达明显上升，同时细胞的培养上清液中TNF-α、IL-1β及MCP-1水平也显著升高。通过激光共聚焦显微镜中也可以看出高糖可以增加TLR4及iNOS的荧光强度，敲除TLR4基因后可以同时使iNOS荧光强度减弱，这提示TLR4及其下游的两种信号通路可调节巨噬细胞激活。

PF作为TGP的主要生物活性成分，近几年在临床越来越多地被用来治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和系膜增生性肾炎等疾病[13-15]，PF的药理作用可能与抗炎、抗氧化和免疫调节有关，但是PF对肾脏保护作用的具体信号通路机制仍然是不明确的。本实验室前期的研究[4]证实了TGP可抑制肾小球和肾小管-间质巨噬细胞TLR4的表达,在本实验中，可以观察到PF对体外高糖刺激的BMDMs激活起到抑制作用，可减少炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1及巨噬细胞表面活化标志物iNOS的产生；这些证实了PF具有抗炎作用；同时观察到PF对正常糖浓度下的BMDMs及TLR4信号通路无影响，但是对高糖刺激下的BMDMs的TLR4及其下游信号通路有抑制作用，由此可以推测，PF是通过抑制高糖刺激下TLR4信号通路的上调而调节巨噬细胞活化的。另外，还可以观察到，在敲除TLR4基因后，继续给予PF干预，仍然可以进一步抑制BMDMs的激活，TNF-α、IL-1β、MCP-1及iNOS的产生也进一步减少，MyD88、p-IRAK-1、Trif、p-IRF3、NF-κBp65和NF-κBp-p65表达减弱，由此可以推测PF对巨噬细胞激活的抑制作用可能还与其他的信号通路有关，其具体的机制有待进一步研究。

综上所述，高糖刺激可以导致巨噬细胞的TLR4信号通路激活，同时启动巨噬细胞活化，PF可以通过抑制巨噬细胞TLR4信号通路的上调从而调节巨噬细胞的活化，但是PF的抑制作用是否同时与其他信号通路有关还需深入研究。

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