重组人表皮生长因子融合蛋白发酵条件优化

杨慧慈 江晓霞 张建 张庭华 周立成 张淳

【摘 要】目的：优化GST-hEGF融合蛋白工程菌pGEX-EGF/BL21STAR（DE3）pLysS 30L发酵罐培养及表达条件。方法：上罐发酵采用M9-YT-Glu发酵培养基，IPTG诱导；通过还原SDS-PAGE法测定目标蛋白表达量、落计数法测定质粒丢失率，以确定表达温度、时间以及IPTG添加量等参数。结果与讨论：hEGF重组菌诱导温度为30℃、加入终浓度0.2M IPTG诱导，维持诱导时间4hr，目的蛋白表达量占菌体蛋白总量的30%左右，为后续rEGF融合蛋白纯化奠定了基础。

【关键词】人表皮生长因子；融合蛋白；发酵条件优化

【中图分类号】R786 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）04-0-01

人表皮生長因子（hEGF）由Cohen等人于1975年从人体尿液中分离得到，又被称为抑胃素（Urogastrone）[1]。hEGF在多种疾病（如角膜损伤和糖尿病足等）的治疗中体现出显著的效果[2]，其药用开发具有巨大的潜力；同时，EGF在美容方面的功效已被消费者广泛认可，相关产品的市场需求日益增大。然而，天然提取高活性EGF售价近200万美元/克，提取效率极低，无法大规模工业化制备，高质量EGF原料的生产供应远不能满足市场需求。因此，开发一种高效的EGF生产工艺不仅具有巨大的经济价值，也为EGF进一步应用开发提供了最基本的保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。pGEX-EGF/BL21STAR（DE3）工程菌由临沂大学药学院构建。

1.1.2 培养基。（1）LB液体培养基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl，pH 7.0，121℃灭菌20 min ；（2）LB固体培养基：在LB液体培养基中补加1.0%琼脂；（3）含氨苄青霉素的LB（LA）液体（或固体）培养基：待LB液体（或固体）培养基灭菌后降温至50℃以下，加入氨苄青霉素（100 μg/mL）；（4）M9-YT-Glu发酵培养基：0.5%胰蛋白胨，0.3%酵母提取物，0.06%NaCl，0.5%KH2PO4，3%Na2HPO4·12H2O，1%葡萄糖，0.1%MgSO4，0.1%NH4Cl；（5）补料培养基：30%葡萄糖，5%胰蛋白胨，3%酵母提取物。

1.1.3 主要试剂。胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxoid公司，中分子量蛋白质Marker购自天根生化科技有限公司，IPTG购自索莱宝，无机盐、葡萄糖等购自上海生工。

1.1.4 主要仪器设备。HSX-150恒温恒湿箱，上海申贤恒温设备厂； HNY恒温培养振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司；ChampGel 5000数码凝胶成像分析系统，北京赛智创业科技有限公司；TU-1810紫外可见分光光度仪，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌密度测定。用紫外可见光光度法测定发酵液600nm波长时光吸收值[3]，以未接种培养基作参比。

1.2.2 目标蛋白表达水平的测定。采用还原SDS-PAGE电泳考马斯亮兰染色法[4]，电泳凝胶经扫描后分析重组蛋白占菌体总蛋白的百分含量。

1.2.3 质粒丢失率的检测方法。将待测发酵液测OD600值，以无菌水稀释，使培养液均达到OD600为0.2。然后取200μl涂LB平板，37℃培养48hr。从培养好的LB平板上挑一单菌落同时转接到LB和LA平板上，37℃培养48hr。计算菌落数，LB平板上的菌落数为M，LA平板上的菌落数为N，则丢失率计算方法为（M-N）/M×100%。

1.2.4 工程菌的培养方法（30升发酵罐规格）。（1）种子菌的活化：取-80℃，12.5%甘油保存的生产种子库菌种，划线接种于含氨苄（100μg/ml）的LB斜面，37℃培养过夜，挑菌苔于含氨苄（100μg/ml）LB培养基中，37℃，200rpm振摇培养至OD600 为0.4-0.5时，作为活化种子4℃保存。（2）种子液培养：取活化种子，以1：100接种于400ml LB培养基中，30℃，150rpm，培养15hr，作为一级种子液。再以1：10接种于2L LB培养基的三角瓶中，37℃，250rpm，培养2hr，作为上罐种子液。（3）发酵工艺：发酵上罐培养基18L，培养基配方为 M9-YT-Glu。取种子液2000ml，加入发酵罐中，使终体积为20L。调整工艺参数：设定温度37℃，转速300rpm，pH用50%氨水自动调至7.0。当发酵至3-4hr，开始流加营养液。待菌体OD600达到8-12，溶氧值开始上升时，降温至30℃，以不同IPTG终浓度（0.1M、0.2M、0.3M ）进行诱导，诱导时间2-6小时，每1小时取1次样品。样品离心、作SDS-PAGE电泳，观察蛋白表达情况。

2 结果与分析

2.1 诱导温度对蛋白表达的影响

温度在发酵过程中的影响一方面表现在工程菌产物合成的数量，另一方面表现在工程菌自身数量的增长。大肠杆菌的最适生长温度为37℃，是使比生长率达到最大值的温度。将种子液以1：10接入发酵罐中，37℃培养至菌体OD600达到10-12，加入终浓度为0.2M IPTG诱导，同时控制温度至25℃、30℃、37℃，诱导时间4hr，收集菌体进行SDS-PAGE分析。

M：marker；1：37℃表达菌体；2：37℃破菌溶解上清；3：30℃表达菌体；4：30℃破菌溶解上清；

5：25℃表达菌体；6：25℃破菌溶解上清

如图1所示，三个温度均可见明显目标蛋白表达条带，其中37℃和30℃对菌体数量增值及表达量明显优于25℃时表达量；37℃诱导表达后，破菌上清目标蛋白溶解度较低，提示温度过高影响融合蛋白可溶性表达；30℃在不明显降低目标蛋白表达量的同时，可溶性表达比例最高，综上，选择诱导温度为30℃。

2.2 不同IPTG濃度对蛋白表达的影响

在发酵研究中，采用不同时间的多点抽样，测定其菌体OD600值，逐点用计算机描绘出菌体生长曲线，当工程菌生长至对数中期（约4hr），降温至30℃，用IPTG进行诱导，hEGF蛋白表达量可达30%左右。而IPTG作为一种不消耗的诱导物，仅需维持一定的浓度即可持续诱导。所以，本实验筛选了终浓度分别为0.1M、0.2M和0.3M的IPTG进行诱导。

1.对照；2.0.1M IPTG；3.0.2M IPTG； 4.0.3M IPTG

实验结果如图2所示：除0.1M IPTG诱导目的蛋白表达量为20%外，其余两种IPTG浓度诱导的目的蛋白表达量均为31%以上，无较大差别。三种不同IPTG浓度诱导获得的目标蛋白破菌溶解性无较大差异。综合考虑到成本和工艺的稳定性，rEGF发酵IPTG终浓度选择0.2M。

2.3 不同诱导时间对蛋白表达的影响

2.3.1 不同诱导时间质粒丢失率测定 分别在诱导前和诱导后1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr取发酵液测定发酵液上清中乙酸的含量，并通过平板培养法计算不同诱导时间的质粒的丢失率。结果如表1、图3所示。

2.3.3 不同诱导时间蛋白表达量测定 分别取诱导前和诱导后1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr的发酵液样品，进行SDS-PAGE电泳，灰度扫描，并分析诱导时间与蛋白表达量之间的关系。结果如图4所示：①诱导时间为1hr时的目的蛋白表达量为12%；2hr为18%；3hr为25%；4hr为30%；5hr为28.5%；6hr为28.0%。即随诱导时间延长，蛋白表达量呈先增加后降低的趋势，且4hr以后蛋白表达量趋于基本稳定。②诱导4hr后，质粒丢失率为40%，5hr以后质粒丢失显著增加，达到68%，即4hr以后质粒丢失率加快，稳定性降低。

3 结论与讨论

rEGF工程菌的发酵，选择M9-YT-Glu盐培养基作为生产发酵培养基，37℃培养，维持溶氧不低于30%，当菌体密度OD600=10-12时，降低温度为30℃并加入终浓度0.2M IPTG诱导，维持诱导时间4hr，最终菌体密度均可达到OD600值20以上，目的蛋白表达量占菌体蛋白总量的30%左右，为后续rEGF融合蛋白纯化奠定了基础。

参考文献

Gregory，H.，Isolation and structure of urogastrone and its relationship to epidermal growth factor.Nature 1975，257 （5524），325-7.

Hong，J.P.； Jung，H.D.； Kim，Y.W.，Recombinant human epidermal growth factor （EGF）to enhance healing for diabetic foot ulcers.Ann Plast Surg 2006，56 （4），394-8； discussion 399-400.

Sezonov，G.； Joseleau-Petit，D.； D'Ari，R.，Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.J Bacteriol 2007，189 （23），8746-9.

Pickles，J.； Rafiq，S.； Cochrane，S.A.； Lalljie，A.，In vitro pepsin resistance of proteins：Effect of non-reduced SDS-PAGE analysis on fragment observation.Toxicol Rep 2014，1，858-870.