胎龄≤34周的汉族早产儿脐带血内皮型一氧化氮合成酶基因多态性及其与早产儿主要并发症的关系研究

常绍鸿，栾斌，张卫星

一氧化氮（NO）是人体重要的神经递质和舒血管因子，对维持血压稳定具有重要作用。内源性NO主要受一氧化氮合成酶的调节，其中内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）是一氧化氮合成酶的一个亚型，大量研究证实eNOS基因多态性可改变NO产生水平，并与多种疾病的发生、发展有关［1-2］。国外有研究证实eNOS基因多态性与早产儿的主要并发症有关，但结论并不一致［3-4］。目前，国内罕有这方面的研究，本研究以新乡市汉族早产儿为研究对象，探讨eNOS基因多态性与早产儿主要并发症的关系，为精准医疗提供临床证据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年2月—2016年12月于新乡市中心医院出生的早产儿，符合以下条件者入选本研究：（1）父母均为汉族，祖籍均为河南北部；（2）出生时胎龄≤34周。排除标准：（1）已知的先天性畸形，如先天性心脏病、先天性神经管发育异常等；（2）已知的染色体异常，如21-三体综合征、18-三体综合征等，以及明显的面容异常伴有掌指纹异常者；（3）多胎。早产儿法定监护人了解本研究过程，并签署书面同意书。最终入选早产儿231例。

1.2 观察指标

1.2.1 产科记录 包括孕周、母亲分娩方式及新生儿的性别、出生体质量、5 min阿氏评分；产前行激素治疗情况。

1.2.2 儿科记录 包括患儿住院情况及主要并发症、结局。

住院情况：肺表面活性物质（PS）应用、行有创机械通气治疗、发生低血压或休克、发生败血症、发生动脉导管未闭、吸氧治疗、发生呼吸暂停的情况。

主要并发症：包括支气管肺发育不良（BPD）、坏死性小肠结肠炎（NEC）、早产儿视网膜病（ROP）Ⅲ～Ⅴ期、脑室周围-脑室内出血（PIVH）Ⅲ～Ⅳ级、需要行有创机械通气治疗的新生儿呼吸窘迫综合征（RDS）。

BPD、NEC的诊断及分级依据《实用新生儿学》［5］。ROP的筛查时机、诊断标准和分期依据文献［6］。PIVH确诊主要依据颅脑超声和颅脑MRI检查结果，少数依据颅脑CT检查结果［5］。RDS的诊断依据参考文献［7］，当满足以下条件之一时给予气管插管、机械通气治疗：（1）频繁呼吸暂停；（2）吸入氧浓度=0.6，且氧分压＜50 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）或者经皮血氧饱和度＜85%（紫绀型先天性心脏病除外）；（3）二氧化碳分压＞60～65 mm Hg，伴有酸中毒（pH＜7.20）。

考虑患者的临床治疗方法和预后不同，本研究仅对ROPⅢ～Ⅴ期、PIVH Ⅲ～Ⅳ级、需要行有创机械通气治疗的RDS的早产儿的诊治资料进行分析。

结局分为死亡和未死亡。死亡病例是指住院时间超过72 h因病情严重而放弃治疗，且放弃治疗后8 h内死亡的早产儿；不包括家属要求姑息治疗且生后24 h内死亡的早产儿。

1.3 基因多态性测定 患儿均于脐带结扎后立即取脐动脉血5 ml，采用北京天根公司基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，eNOS基因多态性位点的引物设计参照文献［8］，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。rs2070744引物为：上游5'-GTGTACCCCACCTGCATTCT-3'，下 游 5'-CCCAGCAAGGATGTAGTGAC-3'；rs1799983 引物 为： 上 游 5'-CACTCCCCACAGCTCTGCAT-3'， 下游 5'-CAATCCCTTTGGTGCTCACG-3'；rs61722009引 物为： 上 游5'-CTATGGTAGTGCCTTGGCTGGAGG-3'， 下 游5'-ACCGCCCAGGGAACTCCGCT-3'。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料以（）表示，计数资料以相对数表示；采用单因素分析和多因素Logistic回归分析分析各基因多态性与主要并发症的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料及主要结局 231例早产儿中男109例、女122例，出生体质量为（1 770.8±632.1）g。其中PIVH Ⅲ～Ⅳ级早产儿54例（23.4%），需要行有创机械通气治疗的RDS早产儿63例（27.3%），ROP Ⅲ～Ⅴ期早产儿32例（13.9%）。一般资料及主要结局见表1。

表1 231例早产儿部分一般资料及结局Table 1 Baseline data and main outcome of 231 Han premature infants of≤34 weeks' gestational age

2.2 最小等位基因频率（MAF） 231例早产儿单核苷酸多态性（SNP）位点及基因型分布见表2。rs2070744 C MAF为0.145、rs1799983 T MAF为0.188、rs6172009 a MAF为0.159。本研究与Ensembl数据库中的中国北京汉族（CHB）和中国南方汉族（CHS）［9-10］rs2070744和rs1799983 MAF比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3），提示本研究对象有代表意义。因Ensembl数据库中缺乏中国汉族rs61722009基因型和等位基因数据，未进行相关比较。

2.3 单因素分析 单因素分析结果示rs2070744的TC+CC基因型和rs1799983的GT+TT基因型分别增加了BPD的发生率，差异有统计学意义（P＜0.05）；rs1799983 GT+TT基因型增加了ROP Ⅲ～Ⅴ期发生率（P＜0.05，见表4）。

2.4 多因素Logistic回归分析 多因素Logistic回归分析结果示rs2070744 TC+CC基因型为早产儿发生BPD的独立危险因素（P＜0.05，见表5）；rs61722009 aa+ab基因型和rs1799983 GT+TT基因型同时存在是早产儿发生ROP Ⅲ～Ⅴ级发生的独立危险因素（P＜0.05，见表6）。

表2 231例早产儿SNP位点及基因型分布〔n（%）〕Table 2 Distribution of SNP and genotypes in 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

表3 本研究等位基因频率与Ensembl数据库已知数据比较〔n（%）〕Table 3 Allele frequency in this study versus known data in Ensembl genome database

表5 早产儿发生BPD影响因素的多因素Logistic回归分析Table 5 Multiple Logistic regression analysis of the associated factors of BPD in 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

表6 早产儿发生ROP Ⅲ～Ⅴ期影响因素的多因素Logistic回归分析Table 6 Multiple Logistic regression analysis of the associated factors of stage Ⅲ - Ⅴ ROP in 231 Han premature infants of ≤ 34 weeks' gestational age

表4 基因型与早产儿主要并发症的关系〔n（%）〕Table 4 Relationship between genotypes and the major complications of 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

3 讨论

随着新生儿救护技术的提高，早产儿存活率明显提高，同时早产儿相关的严重后果也越来越受到关注，并成为一个重要的社会问题。受早产儿自身发育的特点和医疗操作的影响，早产儿更容易发生全身和/或局部组织器官的血流动力学改变，有证据显示这种血流动力学改变和多种早产儿严重并发症相关［11-12］。

一氧化氮合成酶有3种同工酶，即内皮型、神经型和诱导型，其是不同基因编码的结果，且作用于不同器官产生不同的病理生理作用［13］。eNOS在血管内皮细胞内产生内皮型一氧化氮（eNO），eNO是重要的舒血管因子，在维持血管张力的恒定和调节血压稳定性中发挥重要作用。当血管受到血流冲击，灌注压突然升高时，可舒张动脉血管，降低全身动脉血压，控制全身血管床的静息张力，同时也可增加局部血流、抑制血小板和白细胞聚集、维持器官血流量的相对稳定。eNOS基因多态性普遍存在，共有10余种，研究证实，其中1种单核苷酸多态性与临床各种疾病密切相关，分别是：（1）位于第4内含子区，有重复4次、5次两种形式，称为4b/a，在NCBI的序列号为rs61722009；（2）位于启动子区的第786号位点的T置换为C，称为T786C，在NCBI的序列号为rs2070744；（3）位于第7外显子区的第894号位点的G置换为T，称为G894T，在NCBI的序列号为rs1799983［14］。大量研究表明，eNOS基因多态性影响了人体内NO水平，从而影响多种疾病的发生发展过程［1-3］。

关于eNOS基因多态性与早产儿结局的关系，国外有研究发现早产儿脑瘫的发生和eNOS基因多态性有关［15］，随后多国学者对不同人群进行了范围更广的研究，RUSAI等［16］以105例出生体质量≤2 000 g且为ROP Ⅲ～Ⅴ期的早产儿为观察组，127例同体质量患ROPⅠ～Ⅱ期的早产儿为对照组，研究发现eNOS基因4b/a多态性中，aa基因型为ROP Ⅲ～Ⅴ期的高危因素，与T786C无关。而YANAMANDRA等［17］研究却发现T786C多态性明显增加了ROP的发生率，其研究对象为146例美国早产儿，包括白种人和非裔美国人，该研究还报道等位基因C的基因频率在白种人和非裔美国人之间有明显区别，提示不同人种之间基因的差别可能是非裔美国人发生ROP的概率明显小于白种人的原因。其他早产儿并发症的研究也出现了不一致的现象，VANNEMREDDY等［3］研究124例非裔美国早产儿，结果提示T786C基因多态性是PIVH的独立危险因素；一项来自波兰波兹南医科大学的研究却认为T786C多态性与PIVH无关，而G894T多态性才是PIVH的高危因素［18］。不仅是人种不同而造成研究结果不同，DEMIRCUBUK等［19］研究结果显示不同性别相同基因型患者患病率也不一样，其研究对象为127例胎龄＜37周的土耳其患儿，测定rs1799983多态性，发现男性TT基因型和女性GG基因型更容易发生RDS。

本研究入选的患儿均为汉族，且祖籍均为河南北部，rs2070744和rs1799983基因型和等位基因频率与Ensembl数据库中的CHB、CHS已知资料比较［9-10］，均无明显差异，说明本研究入选对象具有代表性，研究结果具有普遍意义。同时也说明取脐带血测定新生儿基因多态性这种方法是可行的。本研究结果提示rs2070744 TC+CC基因型为发生BPD的独立危险因素（P＜0.05），虽然单因素方差分析提示rs1799983 GT+TT基因型增加了BPD的发生率，但多因素Logistic回归分析提示其并不是发生BPD独立危险因素。佛罗伦萨卡雷吉大学医院的研究结果与本研究不同，其认为rs2070744 TC+CC和rs1799983 GT+TT基因型均是BPD的高危因素［4］，其研究对象为342例胎龄≤28周的白种人早产儿，研究对象标准的不同可能是结果不同的原因。本研究中eNOS基因的3种单核苷酸多态性均不是ROP Ⅲ～Ⅴ期的高危因素，而rs61722009 aa+ab基因型和rs1799983 GT+TT基因型同时存在时，ROPⅢ～Ⅴ期发生率明显增高（P＜0.05），与国外的研究有所不同［16-17］。至于需要行有创机械通气治疗的RDS、PIVHⅢ～Ⅳ级、NEC，均与这3种单核苷酸多态性无关。

本研究结果提示测定eNOS基因多态性有助于评估早产儿主要并发症的发生风险，有助于临床上精准医疗方法的选择。同时，既往作为医疗废物的脐带血可以充分利用，尤其是对于可能患多种并发症的早产儿来说，更具有可利用的价值。该研究的不足之处在于样本量稍小，其结果仍需要不同人群更大样本量的实验数据的支持。

作者贡献：常绍鸿进行文章的构思与设计，文章的可行性分析，文献/资料收集、整理，撰写论文；常绍鸿和张卫星进行论文的修订和英文的修订；栾斌负责文章选题指导、质量控制及审校、监督管理。

本文无利益冲突。

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