酶促反应循环烟酰胺型辅酶研究进展

郑远迪 惠秀娟

烟酰胺型辅酶作为最为常见的一种辅酶，参与到多种生物体的氧化还原反应中。在体外酶反应的过程中，辅酶的需求量很高，为了节省成本，辅酶循环路径成为了众多研究的焦点，本文选取近年来在这方面的研究进展进行总结。

1 介绍

辅酶是一种可以与酶蛋白松散结合的有机小分子，对于促进特定酶反应的过程有十分重要的意义。辅酶Ⅰ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）与辅酶Ⅱ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）均为重要的核苷酸类辅酶。烟酰胺型辅酶NAD（P）H作为氧化剂或还原剂直接参与到含有氧化还原酶的酶促反应中，加快了反应速率。

但烟酰胺型辅酶NAD（P）H价格昂贵，辅酶成本往往大于产物收益，因此如何将辅酶进行循环利用是十分重要的课题。NAD+和NADP+为氧化态， NADH、NADPH为还原态， 烟酰胺性辅酶循环再生的基本原理为氧化态辅酶和还原态辅酶通过加氢或脱氢的氧化还原反应相互转化。

辅酶循环研究目前有酶法，电化学法，光化学法等多种方法。根据分离难易程度，反应动力学以及反应成本等多方面考虑，在反应体系中构建多酶催化从而实现辅酶循环再生的方法最为经济实惠。

2 烟酰胺型辅酶循环

2.1 NAD+与NADH循环

NAD+参与的氧化还原反应中，起到电子和氢传递作用的主要是分子中的烟酰胺单核苷酸（NMN），可结合的酶种类较多，研究意义重大。

Francesco G. Mutti，等人在通过双酶氢借用级联将醇转化为对映体纯的胺的实验中， 选择了一种高度对映选择性催化氢化的伯和仲醇，只需要两个生物催化剂，即ADH和胺脱氢酶（AmDH）。氧化还原自足循环使用铵离子/氨作为氮源并仅产生水作为副产物。级联仅需要催化量的烟酰胺辅酶，其将氢化物从氧化步骤转移到还原步骤。该方法已成功地应用于具有反转构型的光学活性仲醇的胺化，并且在第一步与第二步反应中间实现了辅酶循环。

多酶反应步骤复杂，不局限于一组辅酶循环。Rongsheng Tao 通过由L-苏氨酸脱氨酶催化的脱氨基后续氢化反应进行L-2-氨基丁酸的生物合成，然后由L-苏氨酸由L-苏氨酸与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶作为NADH再生系统催化的氢化反应。刘珊等人在合成L-2-丁酸的研究中，就在一锅反应的体系中用到了酮还原酶作为辅酶循环体系的关键酶，产物易分离，降低分离成本跟时间。

全细胞催化反应中，也会设计加入辅酶循环系统来完成复杂转化。W. Brian Whitaker构建重组大肠杆菌，使其可以利用甲醇作为碳源，转化生成生物量成分和高价值特种化学品。该研究中并未组成完整的闭合环路来循环辅酶，而是在多个酶促反应中，构建多个辅酶利用途径，从而达到整体辅酶总量的循环。全细胞催化反应不仅反应稳定，而且辅酶跟酶可以附着在细胞器上达到最大利用效率。

固定化酶技术也可用于辅酶循环研究。Jinglin Fu 设计和构建人工摇摆通道多酶复合物与NAD +修饰的分子臂，以转移两个脱氢酶之间的氢化物。摇摆臂不仅显着增强酶活性，而且在复杂环境中提供高特异性。辅酶因子距离摆动臂的距离以及游离度对整个反应进程都有着影响。Muqing Zheng， Zhiguo Su 将谷氨酸脱氢酶（GluDH），葡萄糖脱氢酶（GDH）和辅因子NAD（H）的多酶系统固定在磁性纳米颗粒上，在外加磁场中能提高辅酶循环效率和酶稳定性。

2.2 NADP+与NADPH循环

相比于NAD（H），NADP（H）的价格更为昂贵，如果能够实现高效的循环再生，则能显著提高反应的经济效益。由于NAP（H）的应用广泛程度不如NAD（H），因此研究进展相对较少。

茅佳灵和许琳研究乳酸合成体外代谢途径时，构建了辅酶ⅡNADP+與NADPH循环。利用反应体系中的乳酸脱氢酶和非磷酸化的3-磷酸甘油醛脱氢酶两条路线中的酶反应来实现NADP（H）的循环。并且实验得出结论提高反应体系中NADP+ 初始浓度有利于提高乳酸的产率。

Alexander Dennig 等人研究单取代苯在与三种同时酶的一锅反应中转化为对映纯的L-酪氨酸衍生物反应。这第一步反应是苯首先通过工程化的P450合酶羟基化。第二部反应中工程化酪氨酸苯酚裂解酶催化C-C-偶联反应，随后用丙酮酸和氨作为共底物的酚的不对称胺化。NADPH辅因子再循环与葡萄糖脱氢酶同时进行。

有的反应关键酶就需要用到辅酶促进反应，可在反应中引入第二种酶进行循环反应。Gao， C.Zhang， L的研究构建了由来自氧化葡糖杆菌的NADPH依赖性羰基还原酶（Gox0644）和葡萄糖脱氢酶（GDH）组成的双酶循环系统，更高效的生产了具有经济价值的手性化学品（3S）-乙酰胆碱。

辅酶在酶促反应中起着不可忽视的作用，甚至决定了整个反应的引发和走向。在酶促反应中加入其它酶从而达成辅酶循环目的，既能调节反应平衡，达到最大产率，又能降低成本提高经济效益。但由于多酶反应体系复杂，选取合适的酶构建循环系统成为了今后研究的重点难点。

（作者单位：110000辽宁大学环境学院）