雷公藤多苷对链脲佐菌素诱导糖尿病肾病大鼠糖基化终末产物特异性受体/细胞核因子-κB信号通路的影响*

徐百升， 夏 璐 ， 胡春艳

1.河南大学第一附属医院 血液净化中心(开封 475000)；2.河南省人民医院 血液净化中心 (郑州 450003)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是一种常见且严重的糖尿病微血管并发症，发病率20%～40%[1]，是导致其死亡的主要原因之一，因此，早发现、早治疗对控制延缓DN发展极其重要。目前，尚未明确DN的确切发病机制，多数研究[2]认为，与炎症反应、代谢紊乱、氧化应激、血流动力学改变和遗传等多种因素有关。有研究[3]发现，糖尿病高血糖可诱发产生多种炎症细胞因子和趋化因子，继而引起肾小球细胞外基质积聚，肾小球硬化，最终在DN发生发展过程中发挥重要作用。近年来，新发现的作用于各种肾脏疾病的细胞因子有细胞核因子-κB(NF-κB)，其激活是由晚期糖基化终末产物(AGEs)与糖基化终末产物特异性受体(RAGE)结合而实现的，进而介导多种信号转导途径，促进多种细胞因子及生长因子的合成和释放，诱发多种病理变化，如细胞基质异常增生、炎症反应扩大等[4]，共同参与DN发展过程。雷公藤多苷(TWP)是雷公藤的有效成分，具有多种作用，包括抗炎、免疫抑制、抗感染等，在临床上广泛用于多种原发性及继发性肾小球疾病治疗[5]。将TWP用于DN的治疗，发现DN患者免疫功能提高，同时蛋白尿降低，在DN发生过程中发挥有效拮抗作用。本研究通过观察TWP对DN大鼠RAGE/NF-κB信号通路的影响，旨在探究TWP对DN大鼠肾损伤保护作用的可能机制，为寻求新的DN治疗方案提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供[动物许可证号 SCXK(沪)2012-0002]的74只6～8周龄的健康雄性SD大鼠，大鼠体质量174～208(184.6±7.2)g；饲养条件：温度、相对湿度分别为19～25 ℃、40%～70%；饮食饮水自由；高糖高脂饲料成分：脂肪、蛋白质和碳水化合物各占22%、20%、48%；基础饲料成分：脂肪、蛋白质和碳水化合物各占5%、20%、53%。本研究经动物伦理委员会批准后进行。

1.2 主要试剂与仪器

链脲佐菌素(STZ)(溶于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液，pH 4.4)购自美国 Sigma公司；TWP片(上海复旦复华药业有限公司，国药准字H20053912)。

1.3 DN大鼠模型建立、分组及给药方法

高糖高脂饲料喂养6周后，单次腹腔注射STZ(55 mg/kg)，STZ采用枸橼酸缓冲液(0.01 mol/L)溶解，维持pH值在4.4，72 h后于空腹状态下取尾静脉血，检测血糖含量。注射STZ 1周后，收集大鼠24 h后的尿液以测定24 h 尿蛋白定量(UTP)、尿糖。若血糖超过16.7 mmol/L(即≥16.7 mmol/L)、24 h UTP 超过造模前50%、尿糖超过+++、尿量超过造模前50%，认为DN模型建立成功[6]。DN造模成功大鼠共有60只，按随机数字表法分为4组，每组15只，即模型组和TWP治疗组(低、中、高剂量)，TWP治疗组每日给予TWP混悬液灌胃，剂量分别为4.5、9、18 mg/kg，模型组给予等体积生理盐水灌胃，1 次/d，连续8周给药。另外15只健康SD大鼠给予基础饲料喂养，且每天给予等体积生理盐水灌胃，共8周。整个实验期间，动物进食饮水自由，且降糖药物及胰岛素禁用。

1.4 采集标本及检测血清生化指标

药物干预8周后处死大鼠前，收集24 h尿标本以测定24 h尿蛋白(24 h Upro)；采集大鼠眶下静脉血，离心速度3 000 r/min，离心半径15 cm，离心时间15 min，然后取上层血清，采用全自动生化分析仪测定血生化指标，包括血糖(BG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)，试剂盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供，严格按照试剂盒说明书上的操作检测24 h Upro。

1.5 测定肾脏组织中RAGE和NF-κB的表达水平

大鼠肾脏于处死后迅速取出，冻存于-70 ℃，取部分组织匀浆并进行总蛋白含量测定，提取的总蛋白行Western Blot以检测RAGE和NF-κB的表达水平，一抗4 ℃过夜孵育，所用的一抗为兔抗RAGE多克隆抗体和兔抗NF-κB多克隆抗体，次日孵育二抗1 h，所用二抗为山羊抗兔，采用Gene Tools 图像分析系统对条带灰度值进行测定，蛋白表达量为目的蛋白与内参(GAPDH)的灰度值之比。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组实验大鼠血糖生化指标及24 h Upro含量比较

与正常组比较，模型组和TWP治疗组BG、Scr、BUN及24 h Upro水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，TWP治疗组上述指标均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；且TWP治疗组上述指标呈剂量依赖性降低，TWP低、中、高剂量组上述指标组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 各组实验大鼠血糖生化指标及24 h Upro含量比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与TWP低剂量组比较，&P<0.05

2.2 各组大鼠肾组织RAGE、NF-κB表达水平的比较

与正常组比较，模型组和TWP治疗组RAGE、NF-κB蛋白表达水平均增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，TWP治疗组RAGE和NF-κB蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；且以TWP高剂量组上述指标降低更为明显，差异有统计学意义(P<0.05)(表2和图1)。

组别RAGENF-κB正常组100.00±0.21100.00±0.22模型组211.85±15.16*218.56±16.12*TWP低剂量组188.42±13.13*#176.55±15.00*#TWP中剂量组170.79±13.90*#166.29±14.42*#TWP高剂量组154.80±12.65*#&140.12±13.78*#&F176.35163.89P<0.001<0.001

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与TWP低剂量组比较，&P<0.05

图1 各组大鼠肾组织RAGE和NF-κB蛋白的凝胶条带

注：A：正常组；B：模型组；C：TWP低剂量组；D：TWP中剂量组；E：TWP高剂量组

3 讨论

DN是DM最常见且严重的并发症之一，也是终末期肾病的主要发病原因。近年来，DN的发病率呈逐年递增趋势，在我国慢性肾脏病病因中占第2位。目前，在DN的发病机制中有许多因素涉及，如炎症反应、细胞信号转导异常、缺血缺氧及遗传等，尚未完全阐明DN的具体发病机制。DN患者糖代谢紊乱，血糖升高明显，相关研究[7]证实，高血糖长期刺激的情况下，肾小管间质发生炎症纤维化，肾小管出现硬化，对DN的发生发展起到明显促进作用。

TWP是雷公藤的主要有效活性成分之一，可发挥抗炎、免疫抑制作用，对原发性肾小球肾炎及免疫相关性肾炎的疗效确切[8]。TWP不仅能拮抗炎症反应在DN发生发展过程中的不良反应，还能使DN患者的尿蛋白排泄降低，进而保护肾小管、抑制肾间质纤维化，达到改善肾功能目的。相关动物实验[9]也证实了这一点，发现TWP能减少DN大鼠尿蛋白排泄量、减轻肾脏纤维化程度，进而延缓肾功能进展。本研究发现，对DN模型大鼠给予不同剂量TWP治疗后，BG、Scr、BUN及24 h Upro水平较DN模型组大鼠均降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性降低。这表明TWP能改善DN大鼠的糖代谢紊乱及肾损害，进而改善肾功能，与芦琨等[10]报道一致。

长期高血糖可导致晚期AGEs增多，增多的AGEs结合特异性受体RAGE可使多种信号转导途径激活，如细胞内蛋白激酶 C、NF-κB、蛋白酪氨酸激酶、氧自由基等，释放产生多种炎症因子及细胞因子，引起各种病理变化，氧化应激诱发和炎症反应扩大会对内皮细胞功能造成损伤，且细胞基质增生异常，血流动力学也明显改变[11]。RAGE是一种免疫蛋白超家族成员，组织中表达量较低[12]。本研究发现，TWP治疗后，DN大鼠肾组织中RAGE表达量开始降低，且以TWP高剂量组降低效果更为明显(P<0.05)，提示TWP可能通过降低RAGE表达而发挥DN肾保护作用。RAGE受体的激活能引发下游级联反应，尤其是NF-κB信号通路的激活。NF-κB是一种关键的核转录因子，涉及炎症信号通路，静息状态下，NF-κB存在于胞质中，且无活性，这与结合其抑制蛋白IκB有关[13]；在高血糖刺激下，NF-κB与IκB分离被激活，NF-κB进入细胞核内，与多种细胞因子、趋化因子及细胞间黏附因子等一起参与免疫反应过程，继而导致一系列肾脏病理变化，包括血管内皮细胞损伤、血流动力学异常和细胞基质异常增生等[14]。本研究发现，TWP治疗后DN大鼠NF-κB表达受到抑制，以最高剂量组抑制效果最佳(P<0.05)，提示TWP可抑制DN大鼠肾脏组织中NF-κB的过表达，通过抑制细胞中炎症通路的激活而保护肾功能。康伟等[15]的研究得出与上述类似结论，发现地黄多糖可降低STZ诱导的DN大鼠肾组织RAGE和NF-κB蛋白的表达水平，从而对DN大鼠肾损伤有所改善。

综上所述，TWP对DN大鼠起到一定程度的肾保护作用，机制可能与抑制RAGE/NF-κB信号通路有关。

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