组蛋白去乙酰化酶突变体水解酰基底物的研究

宫艳超，褚文玮，赵伟伟

（天津渤海职业技术学院生物与环境工程系，天津300402）

蛋白质的翻译后修饰与基因转录有着密切的关系，其中，蛋白质的乙酰化与去乙酰化修饰是由组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和组蛋白乙酰化酶（HAT）协同调控的[1]。它们通过调节赖氨酸残基末端的电荷状态，改变蛋白质的结构与功能[2]。

蛋白质的翻译后修饰，在生物体内具有重要的生理功能。目前，体内已经发现了200多种翻译后修饰[3]。除了组蛋白的N-乙酰化修饰，超过1700个人源蛋白被发现是N-乙酰化修饰的底物蛋白[4]，蛋白的酰基化修饰最常见的就是赖氨酸残基末端的乙酰化修饰，除了常见的蛋白质赖氨酸的乙酰化修饰，最近还发现了丙酰化修饰、丁酰化修饰、丙二酰修饰以及巴豆酰化修饰等[5]，但是这些修饰的生理功能以及如何影响基因的调控过程并不清楚[6]。

HDAC家族的蛋白结构分析可以得出，其酶活中心由两个loop组成，组成水解醋酸根的逃逸通道，loop1（蓝色），具有高度保守的GG序列，loop2(粉红色)，具有核心保守序列HH，家族1和家族3，在该酶活中心是GGX-，其中，X是较大的残基，酪氨酸（Tyr）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe），家族2在该酶活中心的序列为PPX-，X位置为较小的甘氨酸（Gly）。以野生型组蛋白去乙酰化酶（HDAC8）为例，GGXHH motif X的位置是色氨酸（Trp），141位的色氨酸位于醋酸根逃逸通道的和酶活中心位置，距离乙酰基只有4 Å左右。

因此，本实验以141位色氨酸为突变位点，分别突变为丙氨酸（Ala）、Gly、组氨酸（His）和 Phe，发现其对酰基底物（A0=Ac-Arg-His-Lys-Lys(Z)-AMC,Z为乙酰）的水解能力较野生型变弱，得出HDAC8的141氨基酸所占空间位置的大小，影响其酶活性。

1 实验部分

1.1 实验材料

实验室保存的pET-22b-hHDAC8为实验中所用HDAC8质粒，用于质粒扩增的菌株E.coli trans 5α（DH 5α）感受态细胞和用于表达蛋白的菌株BL21(DE3)感受态细胞购买于全式金生物技术有限公司，所用细胞株Hela细胞由实验室冻存。

1.2 仪器与试剂

Millipore型纯水仪（苏州赛恩斯仪器有限公司）、BS124S天平（德国 Sartorius）、YC-2层析实验冷柜（北京博医康实验仪器有限公司）、AKTA蛋白纯化仪（通用医疗生命科学上海有限公司）、Hitrap Q离子交换柱（通用医疗生命科学上海有限公司）、Superdex 200分子筛柱（通用医疗生命科学上海有限公司）、还原型谷胱甘肽（上海生工生物工程有限公司）、氯化钠（上海生工生物工程有限公司）、胰蛋白胨（上海生工生物工程有限公司）、酵母粉（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 pET-22b-hHDAC8质粒的定点突变

将pET-22b-hHDAC8的141位Trp定点突变为为 Gly,Ala，Phe，His，并设计其引物，进行突变。

1.3.2 pET-22b-hHDAC8的表达纯化

pET-22b-hHDAC8及其突变体的表达，目的质粒转化到表达菌株BL-21中，取1 μL测序正确的目的质粒加入50 μL感受态细胞BL-21中，冰浴30 min，42℃热激90 s，冰浴5 min，加入850 μL LB培养基，37℃ 220 rpm振荡 90 min，4000 rpm离心6 min，弃去部分上清，重悬涂于含氨苄100 mg/L LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑取阳性单克隆加入含氨苄的LB液体培养基中37℃振荡，过夜培养12 h左右。次日将过夜培养菌液加入1 LLB液体培养基（含氨苄100 mg/L）中，于37℃振荡培养，4～6 h后加入0.4 mM IPTG诱导表达，继续16℃培养18 h后收取菌体。

离子交换层析（Hitrap Q柱），按系统操作执行进行洗泵，结束后将泵头A、B分别放入到抽滤过的His-HDAC8离子交换低盐缓冲液和His-HDAC8离子交换高盐缓冲液中，设置流速，接离子柱，高低盐各处理离子柱三次，最后用5%的His-HDAC8离子交换高盐缓冲液平衡离子柱，上样，待样品进入系统内后，将模式由Inject改为Load,将盐浓度改为15%的His-HDAC8离子交换高盐缓冲液，用15%～35%质量分数的His-HDAC8离子交换高盐缓冲液进行梯度洗脱，1 mL/tube进行适当收集，SDS-PAGE跑胶鉴定。

凝胶过滤层析（Superdex 200），按系统操作执行进行洗泵，结束后将泵头A、B放入到抽滤过的His-HDAC8分子筛缓冲液中，设置流速，接柱，用His-HDAC8分子筛缓冲液平衡Superdex 200，上样，切换模式，并开始收集0.5 mL/tube，SDSPAGE跑胶鉴定。

1.3.3 人源HDAC8蛋白及突变体与酰基底物的酶活测试

纯化的蛋白用紫外分光光度计测定浓度使其浓度2 mg/mL，在黑色96孔荧光板中分别加入40μL浓度为 150μM的 AMC荧光多肽底物，10 μL四种不同突变型的HDAC8酶液和50μL Assay buffer，于37℃恒温振荡反应30 min，注意避光，加入 100μL含10 mg/mL胰酶和200μM SAHA的Trypsin solution终止上述反应，并在37℃恒温振荡器中振荡反应30 min后，在酶标仪中于390 nm/460 nm荧光波长下测定荧光强度，分析数据。

2 结果与讨论

2.1 pET-22b-hHDAC8质粒的定点突变

以pET-22b-hHDAC8为模板，将HDAC8突变成 pET-22b-hHDAC8-W141G、pET-22b-hHDAC8-W141A、pET-22b-hHDAC8-W141F、pET-22b-hHDAC8-W141H,突变后测序结果如下，由测序结果可以看出，本实验需要的位点都实现了定点突变，可以将质粒转化到表达型的菌株，实现后续的表达纯化。

2.2 pET-22b-hHDAC8及其突变体的表达纯化

2.2.1 pET-22b-hHDAC8的表达纯化

本实验将人源的HDAC8蛋白，经超声破碎前，取平衡缓冲液内全菌的样，确定目的蛋白是否在大肠杆菌内表达，超声破碎后，取高速离心后的上清和沉淀的样，上清液挂住，分别取穿透、洗杂、洗杂后的柱料、洗脱、洗脱后的柱料，洗脱步骤可以完全洗脱下目的蛋白，只有少量目的蛋白残留于柱料上，HDAC8蛋白的亲和层析各步骤的结果如图1。

由图1所见，由于HDAC8蛋白的相对分子质量量约43，所以由亲和层析图可以看出：HDAC8蛋白出现在洗脱样品中，可以进行下一步实验。

图1 pET-22b-hHDAC8镍柱亲和纯化SDS-PAGE结果

用10mL KD的浓缩管将HDAC8蛋白的洗脱液浓缩到小体积，由于洗脱buffer含有200 mM的咪唑，300 mM KCl，所以离子交换层析之前，利用buffer，将咪唑换到1 mM以下，300 mM KCl换到50 mM KCl，如图2。

图2 pET-22b-hHDAC8 HitrapQ离子交换纯化峰图

我们将洗脱液经过换buffer之后浓缩到1.5 mL，采用阴离子交换柱Hitrap Q进行纯化，平衡离子柱的浓度为50 mM KCl，蛋白洗脱之前将盐浓度拉至150 mM KCl，洗脱目的蛋白的梯度是150 mM KCl到300 mM KCl，初期的上样过程蛋白有穿透峰，当电导为24 mS/cm左右时，即开始出现目的蛋白峰，SDS-PAGE结果显示11管-18管均为目的蛋白，取11-18管进行下一步纯化，如图3。

取第11-18管用10 mL KD浓缩管进行浓缩，浓缩到500 μL左右的时候，使用Superdex 200进行纯化，平衡Superdex 200，保持离子浓度在150 mM KCl，上样，洗脱，从10 mL左右出现了杂峰，14 mL左右开始出现目的蛋白峰，峰形单一对称，按照峰宽收集蛋白跑胶，SDS-PAGE结果显示19～24 管均为目的蛋白 HDAC8（43 KD），取第 19～24管进行浓缩，-80℃备用，如图4。

图3 pET-22b-hHDAC8 Hitrap Q阴离子交换SDSPAGE结果

图4 pET-22b-hHDAC8 Superdex 200分子筛SDS-PAGE结果

2.2.2 pET-22b-hHDAC8-W141G的表达纯化

本实验纯化四种突变体蛋白，以甘氨酸突变体为例，将HDAC8-W141G蛋白，经超声破碎前后，分别取全菌、上清、沉淀、穿透、洗杂、洗杂后的柱料、洗脱、洗脱后的柱料的样，洗脱步骤可以完全洗脱下目的蛋白，几乎无目的蛋白残留于柱料上，HDAC8-W141G蛋白的亲和层析各步骤的结果如图5。

图5 pET-22b-hHDAC8-W141G镍柱亲和纯化SDS-PAGE结果

由图5可见：由于HDAC8蛋白的相对分子质量约43左右，所以由亲和层析图可以看出，HDAC8蛋白出现在洗脱样品中，可以进行下一步的实验。

我们将洗脱液经过换buffer之后浓缩到1.5 mL，采用阴离子交换柱Hitrap Q进行纯化，平衡离子柱的浓度为50 mM KCl，蛋白洗脱之前将盐浓度拉至150 mM KCl，洗脱目的蛋白的梯度是150 mM KCl到300 mM KCl，初期的上样过程蛋白有穿透峰，当电导为24 mS/cm左右时，即开始出现目的蛋白峰。SDS-PAGE结果显示13管-23管均为目的蛋白，取13-23管进行下一步纯化，如图6。

图6 pET-22b-hHDAC8-W141G Hitrap Q阴离子交换SDS-PAGE结果

取第 13～23管用10 mL KD浓缩管进行浓缩，浓缩到500 μL左右的时候，使用Superdex 200进行进一步的纯化，平衡Superdex 200，保持离子浓度在150 mM KCl，上样，洗脱，从 10 mL到 13 mL出现了杂峰，13 mL左右开始出现目的蛋白峰，峰形单一对称，按照峰宽收集蛋白跑胶，SDSPAGE结果显示20～24管均为目的蛋白HDAC8（43），取第 20～24管进行浓缩，-80℃备用，如图7。

图7 pET-22b-hHDAC8-W141G Superdex 200分子筛SDS-PAGE结果

2.3 野生型及突变型hHDAC8蛋白对AMC荧光多肽底物的水解效果

本实验的实验思路是通过酶学测试，观察野生型HDAC8蛋白及四种突变体对荧光底物的水解能力差异，验证HDAC8的141位与酰基的结合关键点，纯化的HDAC8蛋白及其突变体用紫外分光光度计测定蛋白浓度，使蛋白终浓度为0.2 mg/mL，AMC荧光多肽底物的浓度为150 μM，其它反应时间和终止时间都一致，结果数据显示如图8。

图8 HDAC8蛋白野生型及其突变体对AMC酰化底物的水解

由图8可见：A0为乙酰化AMC四肽底物，野生型的HDAC8对其水解能力最强，四种突变体对该AMC酰基底物水解能力都变弱了，说明141位色氨酸的突变影响了HDAC8的酶活力。

3 结论

在HDAC8蛋白野生型的基础上，将其酶活中心逃逸通道位置的141位的色氨酸分别突变为Ala、Gly、His和 Phe，突变成较小和较大的氨基酸，并纯化表达出相应的野生型和突变体蛋白，然后与AMC荧光底物A0测定酶活性，发现其对酰基底物的水解能力较野生型变弱，因此，得出HDAC8的141氨基酸所占空间位置的大小，影响其酶活性的结论。

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