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不同分子量土鳖虫活性小肽凝胶的透皮特性研究*

2018-06-27刘庆丰孙甜甜丛竹凤

天津中医药大学学报 2018年3期
关键词:透皮分子量凝胶

刘庆丰 ,于 帅 ,孙甜甜,李 敏 ,丛竹凤 ,高 鹏,代 龙

土鳖虫,又称虫、地鳖虫、土元等,始载于《神农本草经》,是中国传统的具有活血化瘀功效的动物药。古代著名医家刘完素曾说道:“郁而不散为壅,必以宣剂以散之。”又如清代医家叶天士曰:“久则邪正混处其间,草木不能见效,当以蚁虫疏通逐邪。”指出土鳖虫、水蛭、天龙等善于钻入狭缝孔隙的动物药,有化瘀通络、祛瘀生新的功效。其雌虫体具有散血瘀、消坚结、解凝活血、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效[1]。有文献报道其对血液流变性各参数的改善作用较强,进一步证明其较强的活血化瘀作用[2]。土鳖虫的主要活性成分包括多种活性蛋白质(酶)、氨基酸、生物碱、脂溶性维生素及脂肪酸、微量元素、挥发油等,以及分离得到的核苷类化合物尿嘧啶和尿囊素,有镇静作用且外用有促进皮肤溃疡面和伤口愈合及生肌作用[3]。

1 实验材料

1.1 仪器 R-301型旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司);CT-241电渗析仪(浙江赛特膜技术有限公司);卷式超滤膜(1KDa、3KDa)(北京市旭邦膜设备有限责任公司);LGJ-10C型真空冷冻干燥机(杭州大卫科教仪器有限公司);电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);AL-204型万分之一天平;KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);UV-1100型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);ermeGear垂直透皮扩散渗透仪(上海玉研科学仪器有限公司)。

1.2 试药及试剂 胰蛋白酶(批号F20071228),酶活力 2 000 U/mg;胃蛋白酶(批号 F20110712),酶活力3 000 U/mg(均购自上海蓝季科技发展有限公司产品);分子量标准品:牛血清白蛋白(MW66430)(上海源叶生物科技有限公司)。

土鳖虫药材(雌虫干燥体,购自济南建联中药店),经山东中医药大学郭庆梅老师鉴定为鳖蠊科中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)的雌虫干燥体。

硫化钠、氯化钠、丙三醇、三乙醇胺、氮酮,以上试剂均为分析纯,卡波姆940,蒸馏水。

SD 大鼠,SPF 级,体质量 200~250 g,由山东中医药大学实验动物中心提供,合格证为SCXK(鲁)201300010。

2 方法与结果

2.1 土鳖虫活性小肽制备 将土鳖虫药材粉碎过60目筛,取1 000 g,加10倍量纯水,煮沸20 min,待水液降温至40℃,用稀盐酸溶液调pH至1.5左右,加胃蛋白酶适量,40℃保温酶解2 h;再用稀氢氧化钠溶液调pH至8.0左右,加入胰蛋白酶适量,40℃保温酶解4 h[4];煮沸10 min灭酶,迅速冷却至室温,放置冰箱低温(4℃左右)冷藏过夜,离心(4 500 r/min)10 min,取上清液经电渗析仪除盐得土鳖虫酶解液[5],再依次用过分子截留量为3 KDa、1 KDa的超滤膜进行超滤,得到不同分子量的土鳖虫活性小肽组分,低温减压浓缩(65℃,-0.07~-0.08 MPa)后进行冻干得不同分子量土鳖虫活性小肽冻干粉(P1:M<1 KDa,P2:1 KDa<M<3 KDa,P3:M>3 KDa),灭菌后-20℃低温保存。

2.2 总肽含量测定

2.2.1 溶液的配制 对照品溶液的制备:精密称定牛血清白蛋白对照品适量,加水制成每1 mL含0.2 mg的溶液,即得。

土鳖虫活性小肽溶液的制备:分别取土鳖虫活性小肽冻干粉(P1:6.45mg、P2:3.12mg、P3:6.35mg),用纯净水定容至25 mL容量瓶中,摇匀,制得P1样品溶液、P2样品溶液、P3样品溶液。

2.2.2 测定方法 按照文献采用福林酚比色法测定总肽含量[6],依次测定对照品及P1样品溶液、P2样品溶液、P3样品溶液的吸光度,绘制标准曲线,得回归方程为:Y=0.482 5X+0.029 7(r2=0.997 6),并计算不同分子量土鳖虫活性小肽的总肽含量。结果见表1。

表1 不同分子量土鳖虫活性小肽肽含量均值(n=3)

实验结果得出,3种不同土鳖虫溶液中,均含有活性肽,其中P2溶液中含肽量最高,占总质量的70.84%,P1溶液中含肽量最少,占总质量的40.13%。

2.3 不同分子量土鳖虫活性小肽凝胶体外透皮特性研究

2.3.1 土鳖虫活性小肽凝胶的制备 凝胶基质配方:卡波姆940,30 g(提前加入蒸馏水中充分溶胀成1%的溶液),丙三醇4 g,土鳖虫活性小肽0.2 g,蒸馏水15 mL,氮酮1 g,三乙醇胺0.1 g,共计50 g。

不同凝胶样品制备:将不同分子量的土鳖虫活性小肽P1、P2、P3溶于15 mL蒸馏水中,加入充分溶胀的卡波姆溶液,混匀,依次加入甘油、氮酮,边搅拌边滴加三乙醇胺至凝胶pH为7左右[7],即得土鳖虫活性小肽P1凝胶样品、P2凝胶样品、P3凝胶样品。

离体鼠皮制备:取SD大鼠,断颈处死,立即剥离大鼠腹部及背部皮肤,用8%硫化钠溶液脱毛,并小心剔除多余皮下组织,再用生理盐水清洗干净,于4℃保存备用,1周内用完。实验前检查皮肤的完整度,避免破损。

2.3.2 透皮扩散实验方法 将处理好的皮肤固定于Franz扩散池,供给池与接收池之间,角质层面向供给池,接收池注满生理盐水并排净气泡,取1 g凝胶均匀涂布于鼠皮上,300 r/min,37℃保温开始计时,分别于 1、2、4、6、8、10、12、24 h,取出全部接收液并立即补加等量的接收液,接收液浓缩至1.5 mL,再进行肽含量测定[8-10]。其中,接收池体积为15 mL,有效透过面积为3.14 cm2。

式中Q为累积渗透率,Cn为t时接收液肽浓度,V为接收液体积,m0为凝胶含有的初始肽量。以累积渗透率Q(%)对时间t(h)作图,得累计透皮曲线。

2.3.3 土鳖虫活性小肽水溶液与凝胶剂透皮性比较 按照2.3.1项下方法分别制备P1、P2、P3凝胶样品,并制备等浓度的小肽水溶液样品,采用上述透皮扩散实验方法,比较P1、P2、P3水溶液与凝胶剂在大鼠皮肤中的渗透性。结果见表2。

结果表明,P1、P2、P3凝胶剂在大鼠皮肤中的渗透效果均优于水溶液,透皮吸收率均明显提高,说明将土鳖虫活性小肽制成凝胶剂型有利于提高其渗透性,由于凝胶基质中含有氮酮等促渗剂成分,因此渗透性要比水溶液好很多。

表2 P1、P2、P3水溶液与凝胶剂累计渗透率比较

2.4 体外透皮扩散实验

2.4.1 不同大鼠皮部位对土鳖虫活性小肽P1凝胶剂透皮性的影响 按照2.3.1项下方法制备土鳖虫活性小肽P1凝胶样品,并按2.3.1项下方法制备大鼠腹部及背部皮肤,采用上述透皮扩散实验方法,比较小肽P1凝胶在大鼠不同皮肤部位中的渗透性,结果见表3。

表3 不同大鼠皮部位对P1凝胶累计渗透率比较

结果表明,背部皮肤累计渗透率为54.03%,明显小于腹部皮肤96.19%,单位面积渗透量腹部是背部的1.74倍,因此,实验选择大鼠腹部皮肤进行体外透皮实验。

2.4.2 不同促渗剂对土鳖虫活性小肽P1凝胶剂透皮性的影响 按照2.3.1项下方法分别制备含3%氮酮、3%PEG400、3%油酸不同促渗剂的小肽P1凝胶样品,采用上述透皮扩散实验方法,比较同浓度不同促渗剂对P1凝胶在大鼠皮肤中渗透性差异。结果见表4。

表4 不同促渗剂对小肽P1累计渗透率比较

结果表明,3种不同促渗剂对P1的渗透效果:氮酮>油酸>PEG400,且氮酮的单位面积渗透量分别是PEG400、油酸的1.77倍、1.54倍,说明氮酮的促渗效果更好,这可能与氮酮对皮肤的作用机制有关,它在细胞间类脂膜双分子层结构中发生作用,使其致密性降低,流动性增加[11]。

2.4.3 不同浓度氮酮对土鳖虫活性小肽P1凝胶剂透皮性的影响 按照2.3.1项下方法分别制备含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮小肽P1凝胶样品,采用上述透皮扩散实验方法,比较不同浓度氮酮对P1凝胶渗透性的影响。结果见表5。

表5 不同浓度氮酮对小肽P1累计渗透率比较

结果表明,3种浓度的氮酮对土鳖虫活性小肽的促渗作用基本无区别[12],选取1%氮酮作为渗透剂即可满足实验要求。

3 讨论

通过本实验,采用酶解方法和超滤法得到3种不同分子量的物质,分别为P1、P2、P3。同时folin肽含量测定方法对3种物质进行肽含量测定,得出含肽量顺序为 P2>P3>P1。但是通过对比 P1、P2、P3 凝胶及其水溶液的累计渗透率,得出分子量越小的透皮性越好,即P1凝胶透皮效果最佳。并通过不同大鼠皮肤透过实验,得出P1凝胶在大鼠腹部皮肤透皮效果更好,P1凝胶累计渗透率可达94.26%。通过对比含3%氮酮、3%PEG400、3%油酸不同促渗剂的小肽P1凝胶样品,3%氮酮对P1凝胶样品促渗作用更强,累计渗透率达96.43%。同时对比含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮小肽P1凝胶样品,最后得出不同浓度氮酮对P1凝胶渗透性影响差异不大。

根据人体皮肤吸收原理,分子量越小的物质越易被皮肤吸收,本实验得出土鳖虫活性小肽3种物质中的P1透皮效果优于其他两种物质,佐证了这一吸收原理,但是土鳖虫活性小肽P1组分中可能含有游离氨基酸,氨基酸分子量小,易被人体皮肤吸收,这可能是造成P1组分透皮吸收率高的原因之一。后期实验需对P1组分进行进一步纯化,去除游离氨基酸后再进行透皮实验。

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