小花鬼针草总黄酮的抗菌研究

曹铭晨，方孟香，黄 欣

鬼针草，又名婆婆针，为菊科一年生植物鬼针草（Bidensbipinnat a L.）的干燥全草，中国大部分地区均有分布。鬼针草始载于唐代《本草拾遗》，有解热、止泻、解毒和活血散瘀等功效，曾被收录于1977年版《中国药典》。从鬼针草中分离得到活性化合物成分有黄酮类、聚炔类、有机酸及其酯和挥发油等，在抗高血压、抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗炎、保肝护肝、抗结石等方面均表现出药理活性[1-2]。据报道，鬼针草的水提液可抑制堪萨斯分枝杆菌生长[3]，醇提物则对金黄色葡萄球菌、黑根霉菌、链格孢菌及灰葡萄孢菌存在不同程度的抑制作用[4]，表明鬼针草中存在抑菌活性成分。陈飞虎团队筛选发现鬼针草总黄酮为其有效部位[5]，目前关于鬼针草有效部位抗菌活性的研究较少，本研究评价小花鬼针草总黄酮部位的抗菌活性，为鬼针草黄酮类成分的研究与开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津UV-3010型紫外分光光度计，52CS-2旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），METTLERAE 240型电子分析天平（瑞士梅特勒公司），DK-8244电热恒温水浴锅（江苏常州国华电器有限公司），BSP-250生化培养箱（上海跃进医疗器械厂）等。

1.2 实验药品 干燥小花鬼针草药材经山东中医制药系周长征老师鉴定为小花鬼针草（Bidens parviflora willd.）。

1.3 实验菌种 黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌由某医院提供，购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.4 试剂与试药 95%乙醇、乙醇购自山东省禹王化工分公司，石油醚、乙酸乙酯、M-H培养基、琼脂购自国药集团化学试剂有限公司，氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。蒸馏水为自制，水为杭州娃哈哈纯净水，芦丁标准品购自中国药品生物药品检定所。

2 方法与结果

2.1 小花鬼针草总黄酮制备 参照文献[4-6]标准。

2.1.1 提取 取干燥小花鬼针草适量，粉碎后称取20 g置圆底烧瓶中，加入50%乙醇200 mL加热回流1 h后滤过，再加入50%乙醇200 mL加热回流1 h，合并滤液；以石油醚萃取至石油醚层无色，弃去石油醚层；再加乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯部位65℃减压浓缩至10 mL。

2.1.2 精制 以大孔树脂AB-8柱层析分离，蒸馏水洗脱至无色，70%乙醇洗脱300 mL，收集有黄酮颜色反应的洗脱液，浓缩后真空干燥即得。

2.1.3 含量测定 依据2015年版《中国药典》山楂叶中总黄酮含量的测定方法，以芦丁为对照品，用紫外-可见分光光度法测定小花鬼针草总黄酮的含量。

2.1.3.1 线性关系考察 测定不同浓度芦丁标准品溶液在510 nm波长处的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=3.035 9X+0.007 4（r2=0.999 9）。结果表明，芦丁检测浓度在0.0261 6～0.130 80 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.1.3.2 样品含量测定 精密称定总黄酮样品10 mg，平行5次测定，结果见表1，样品中平均黄酮含量为74.76%。

表1 鬼针草总黄酮部位中的黄酮含量测定结果（以芦丁计）

2.2 小花鬼针草总黄酮抑菌实验

2.2.1 K－B纸片药敏实验

2.2.1.1 菌液配制 将4种菌分别接种于琼脂培养基，37℃培养24 h，用接种环挑取形态相似菌落5～6个，接种于10 mL的 M－H培养基中，37℃培养3 h；用生理盐水配制成0.5麦氏/比浊标准，即含1×108CFU/mL的菌悬液。

2.2.1.2 纸片制备 精密称取总黄酮样品10 mg至100mL容量瓶，以75%乙醇溶解并以蒸馏水定容，摇匀，取该溶液适量分别以蒸馏水稀释成浓度为10、30、50、70、100μg/mL的总黄酮溶液；将空白药敏纸片（6 m m）分别置于西林瓶（蒸馏水清洗后高热灭菌，备用）中（1片/瓶），分别加入不同浓度溶液1 mL，均匀吸收后置于37℃恒温箱内干燥。

2.2.1.3 平板接种 分别取上述菌株的新鲜培养物，用涂布棒蘸取适量菌液均匀涂布于整个培养基表面。将含有药样的药敏纸片滤水，微干后铺于平板表面，置37℃恒温箱孵育18～24 h。

2.2.1.4 抑菌环直径测量 培养结束取出平板，测定抑菌环直径并记录。每个样品平行3次测定，取抑菌环直径平均值，结果见表2。

2.2.2 小花鬼针草总黄酮的最低抑菌浓度（MIC）测定 采用倍比稀释法，取试管编号1～8，1号管装1.8 mL液体培养基，2～8号管装液体培养基1 mL。高压灭菌后冷却，无菌操作下，在1号管加入浓度为1 mg/mL的鬼针草总黄酮溶液0.2 mL，摇匀后，从1号试管吸取1 mL混合液移入2号管，依次操作后，1～7号管中，鬼针草提取物浓度依次为100、50、25、2.5、6.25、3.125、1.56 μg/mL。到 8 号管弃去1 mL，8号管作对照管。1～8号试管各加入菌悬液0.1 mL，37℃恒温培养24 h后，肉眼观察对照试管混浊（+，有细菌显著生长），判定澄清（－，无肉眼可见菌生长）试验管的最低浓度为鬼针草对该菌的MIC，结果见表3。

表2 不同剂量小花鬼针草总黄酮对4种细菌抑菌环直径统计结果 μg/片

表3 小花鬼针草总黄酮的最低抑菌浓度

3 小结与讨论

植物源抗菌物质在自然界中广泛存在，植物体内的许多次生代谢产物如生物碱、黄酮类、有机酸类和酚类化合物等存在杀菌活性[7－8]，研究表明植物源黄酮类物质具有广谱抑菌性[9－10]。本实验研究了小花鬼针草乙酸乙酯部位总黄酮对金黄色葡萄球菌等4种菌的抗菌作用，结果显示对大肠杆菌几乎无抑菌作用，对白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌有较好的抑菌作用。与文献报道鬼针草醇提取物在体外对金黄色葡萄球菌和真菌有抑制作用[11－13]一致，提示总黄酮为鬼针草抗菌的有效部位。总黄酮部位对多种菌表现出抑制作用，可能有较广的抗菌谱。

目前已从鬼针草总黄酮中分离出许多单体成分，如 2（R/S）－异奥卡宁－（3′，4′－二甲醚）－7－O－β－D－葡萄糖苷、（Z）－6－O－（6′－O－乙酰基－β－D－吡喃葡萄糖基）－6，7，3′，4′－四羟基橙酮、海生菊苷、异槲皮苷等，并研究各单体成分的抗肝纤维化、抗氧化等药理作用[9－11]，但几乎没有对单体成分的抗菌研究，下一步将筛选乙酸乙酯部位黄酮中的抗菌单体成分，深入探讨其单体活性成分的抑菌机制及其构效关系。本研究为小花鬼针草黄酮部位抗菌作用的深入研究，及作为新型天然植物源防腐剂的开发提供一定的理论依据，促进鬼针草资源更合理的利用。

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