微流控SERS芯片及其生物传感应用

王志乐，王著元，宗慎飞，崔一平

(东南大学 先进光子学中心，江苏 南京 210096)

1 引 言

微流芯片诞生时可能只是作为纳米技术革命的过渡，而由于材料科学、加工工艺的快速发展，微流控技术也有了突破性的进展。微流控系统也被称为“芯片实验室”(lab on a chip，LoC)[1]，具有样品消耗量低、反应时间短、严格操控及便携性等优势。随着微流控技术的进一步发展，研究者们不再满足于只将化学反应搬到芯片中，而是把各种分析物的检测也放在微流中进行。微量样品的检测必然需要高灵敏度的检测方法，于是微流芯片作为一个良好的平台应用于很多检测技术，这使得诸如光学、生物、医学等领域的研究者都对其产生了浓厚的兴趣[2]。

近年来，光学与光谱学技术发展成为了一种高灵敏、快速、高效并且无损的检测成像手段[3]，其中表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是最常用的光谱方法之一。SERS光谱具有诸多优点，例如可作为分子的指纹光谱进行无标检测[4]，其超高的灵敏度可以实现单分子检测[5]，窄峰宽可实现多元检测[6]等，在生物传感上有着广泛的应用。最近，将SERS技术与微流芯片相结合形成的微流控SERS检测芯片(SERS-LoC)成为新的研究趋势：SERS可以检测在微流通道内超低浓度的样品，而微流芯片的多通道设计可以方便的实现多元SERS检测[7]。SERS可以为微流平台提供优秀的检测技术。而通过微流通道制作SERS基底可以解决在溶液中检测时SERS信号无规律波动的问题，从而大幅度提高SERS检测的重复性与可靠性。不仅如此，微流控芯片良好的可操作性也被很多研究者用来控制合成不同形貌的基底以及实现多功能[8]。SERS与微流芯片的结合为两种技术的发展都提供了很多新的机遇，而且二者互补也解决了各自的问题，为多功能的SERS-LoC系统打下坚实的基础，在生物、化学检测，医学诊断等领域都有很大的发展空间[9]。

鉴于SERS-LoC近年来取得的突出研究进展，本文在简要介绍SERS的机理及最近的发展的基础上，重点概述了SERS在生物传感领域中的典型应用，最后讨论了SERS微流控芯片技术及在生物检测中的应用前景及发展方向。

2 SERS原理及发展

自被发现以来，拉曼散射一直倍受关注[10]。拉曼光谱与分子振动能级相关，可以提供每种分子独一无二的“指纹”信息。这使得拉曼光谱在研究物质成份时十分方便有效。同为振动光谱的红外光谱(IR)技术在材料分析等领域也有广泛应用，然而水有着很强的红外吸收，容易产生较强的背景。相反地，水的拉曼散射信号非常弱，不会对样品的信号产生显著干扰。因此，在分析水溶液样品时，拉曼光谱相比红外光谱更有优势。然而，物质的拉曼散射信号强度通常较低，导致拉曼散射光谱技术的灵敏度不高。尤其对于低浓度的痕量样品来说，拉曼散射信号甚至会无法探测到。幸运的是，1974年Fleischmann首次发现粗糙金属表面可以极大地增强拉曼散射，增强倍数可达103～104。这一异常增强现象被称为SERS效应。SERS发现对拉曼光谱的发展产生了深远的影响和有力的推动[11]。其后，人们对SERS效应中金属(特别是贵金属)增强拉曼散射信号的原理进行了深入的研究，目前人们广泛认可的增强机制为长程电磁增强(electromagnetic enhancement,EE)和短程化学增强(chemical enhancement,CE)的协同作用[12]。

金属粒子增强局部电磁场强的能力主要来自于其等离激元(plasmon)的性质。等离激元为金属的自由电子的振荡。等离激元可分为发生在宏观表面的表面等离激元极子(surface plasmon polaritons,SPP)和发生在纳米结构中的局域表面等离激元(localized surface plasmons,LSP)。图1(a)可以显示出这一过程。振荡的电子云与电磁场矢量相反方向运动，在入射光激发下金属纳米粒子会产生自己的偶极子场来增强局域光场。当入射光接近局域表面等离子体共振(LSPR)频率时场增强效果会变得更好。当增强的入射光激发附近的拉曼分子时，散射出来的场又会被金属纳米粒子增强(图1(c)～1(d))。于是有了SERS增强的经典公式：

(1)

式中，Eloc为局域场的振幅，E0为入射场的振幅，εm为金属纳米粒子的介电常数，εs为环境的介电常数(图1(b))。由公式(1)也可推断出最理想的增强金属为铜、银和金，因为这些金属不仅吸光度低，并且可以在光学频率上支持局域表面等离子体共振。处在电磁场的纳米结构在其尖端或边缘增强因子最强，可达到1010数量级。如果将拉曼分子置于纳米粒子表面的这些位置，可以得到非常可观的SERS信号。

图1 (a)电子云振荡的图示，对于小于光波长的纳米粒子而言其电子云振荡方向与电场矢量方向相反;(b)描绘正文中公式1的参数;(c)在光激发下金属纳米粒子发射的偶极子场;(d)入射场和出射场的电磁增强 Fig.1 (a)Illustration of the oscillating electron cloud, which moves in opposite direction of the electric field vector, for a nanoparticle smaller than the wavelength of light; (b)depiction of the parameters used in eq 1 of the main text; (c)emitted dipole field of a metallic nanoparticle under light excitation; (d)EE of both the incident field and the scattered field

相对电磁增强而言，化学增强是一种非常短程的效应，只影响到吸附在金属表面或者几埃(Å)范围内的拉曼分子，而且增强因子通常也比较小，只有101～102。化学增强的机制产生于一个自由分子被金属表面吸引时电子结构的改变，有4种过程可以产生这种化学增强：吸附在金属表面分子极化度的增加；分子-金属复合物的电子转移共振；共振散射的增强以及等离子体共振的增强。这4种过程互相关联，很难单独量化每一个成分对化学增强总体的贡献。

于是SERS信号强度的增强因子(EF)可以由电磁增强(EE)和化学增强(CE)相乘得到(EF=EE×CE)。而这两种增强因子较难量化，因此一般利用以下公式计算增强因子：

(2)

式中，ISERS和IRFM分别表示待测物的SERS信号强度和未经增强的拉曼散射信号强度，Nsurface和Nbulk分别表示SERS和拉曼散射检测中被激发待测分子数。有关SERS的报道中，增强因子从107～1015不等。在实际研究中拉曼分子的SERS增强效果会被很多因素影响，例如分子-金属的相互作用、激发光以及SERS基底。

对于金属表面的拉曼分子而言，分子取向会影响SERS光谱。如果局域电场的极化与金属表面垂直，则吸附分子的拉曼模式中垂直于表面的极化张量被选择性增强。这一选择性增强造成的结果是，不同浓度下SERS光谱中有新的峰出现或有的峰消失，尤其是被测拉曼分子中有很多不同的官能团时这一现象更容易出现。这种现象最早由表面选择规则(Surface Selection Rules,SSR)描述[13]。高度对称的分子散射主要取决于与对称相关的选择性规则，如中心对称的分子吸附到金属表面时其对称性被破坏而使不同的峰被增强。

对于激光的影响，主要是当激发等离子激元的激光频率与分子能量相当时会产生表面增强共振拉曼散射(SERRS)，拉曼信号会得到极大的增强[14]。虽然等离子激元共振频率很难精确的匹配分子的电子转移频率，但在实际研究中发现，即使二者相差250 nm左右时依然可以激发SERRS。与SERS相比，SERRS中的增强因子会有由共振引起的额外的增强效应，但SERRS所得到的强度很大程度上依赖于激发波长。

值得注意的是，SERS基底对SERS信号的影响十分显著，因此SERS基底是很多研究的重点[15]。由于金、银等贵金属的SERS增强效果最佳，一般的SERS研究都以金、银或其合金作为基底。在SERS基底中，能提供拉曼增强的区域被称为热点(hot spot)，主要为纳米粒子的聚集处。热点处的电场被极大地增强，从而产生显著的拉曼增强。至今，研究者们已经提出了各种各样的SERS基底，而这些基底中必不可少的就是为SERS增强做主要贡献的热点区。Song等人[16]的综述文章中将热点的发展分为三代。

第一代SERS基底为简单的纳米粒子结构，如图2(a)～2(c)。这类SERS基底通常是具有特殊几何形貌的金属纳米粒子，他们的尖角或边缘等处可形成有效的热点。因此虽然结构简单，也可以获得较大的拉曼增强效果。典型的代表有，球形金纳米颗粒[17]、球形银纳米颗粒[18]、棒状金纳米颗粒[19]、星形金纳米颗粒[20]、三角形银纳米颗粒等[21]。我们课题组也制备出了多种SERS基底，例如金纳米星[22]、金纳米团簇[23]、银纳米棱镜[24]等(图2(d)～2(f))。

图2 (a)金纳米粒子的TEM图；(b)银纳米粒子的TEM图；(c)盐酸处理过的金纳米棒的TEM图；(d)金纳米星的TEM图；(e)4MBA标记的金团聚体的TEM图；(f)银纳米棱镜的TEM图 Fig.2 TEM image of (a)AuNPs; (b)AgNPs; (c) HCl-treated GNRs; (d)gold nanostars; (e)4MBA-labeled Au aggregates; (f)Ag nanoprisms

第二代SERS基底为纳米粒子组装体，通过组装体内粒子间的电磁场耦合作用产生热点以达到SERS增强的效果。图3是典型的多聚体[25]、纳米卫星[26]的TEM照片。制备这种纳米组装体时，通常需要精密的设计。例如，可通过静电作用、DNA或小分子等进行纳米颗粒的组装，并对组装实验进行优化以保证一定的产率。得益于丰富的热点，利用这类纳米粒子组装体作为SERS基底时，获得的SERS信号强度能比第一代SERS基底高2～4个数量级。

图3 (a)L形纳米三聚体的TEM图，在二氧化硅壳内包裹三个修饰PCEPE的金核；(b)3D自组装等离子体超结构的TEM图，在硅壳内包裹80纳米金核和众多单分散的20纳米金纳米卫星粒子 Fig.3 (a)TEM image of an L-shaped trimer nanoantenna comprised of three Au cores functionalized with PCEPE (structure shown) and encapsulated in a SiO2 shell; (b)TEM images of 3D self-assembled plasmonic superstructure comprising a silica-encapsulated 80 nm Au core and multiple monodisperse 20 nm Au satellite particles

第三代SERS基底指有序的阵列基底，它们可以提供更均匀的SERS增强效果。从整体上看，前两代SERS基底具有较随机的结构，即便是同批制备的基底(例如金纳米星)，彼此之间的SERS增强因子差别仍可能较大，使得SERS信号的均一性不佳。第三代有序阵列SERS基底在第一、二代基底的基础上，将第一、二代SERS基底与硅、PDMS等基质材料结合，制作均匀的阵列结构。例如，使第一代或第二代基底在硅衬底上以一定的规律排布，即可获得按规律排列的热点阵列。如图4，经典的第三代SERS基底有纳米天线阵列[27]、纳米柱阵列[28]、SHINERS阵列[29]、纳米球平板印刷(NSL)阵列[30]等。这些阵列基底的制备大多采用物理方法，利用高度发达的纳米工艺对材料的形貌实现精密的控制。规则的阵列可以使SERS热点排布更加均匀，测得的信号也具有良好的可重复性及可靠性。SERS基底制备工艺的发展对推进SERS的应用起到了关键作用。正是由于SERS基底有着如此多元的制作方法和工艺，使人们可以方便地赋予SERS很多功能，因而SERS正逐渐被应用于越来越广泛的领域。

图4 (a)BT修饰的Ag-PAO模板的SEM图，由氧化铝基质在0.1 M氢氧化钠溶液中部分分解得到；(b)52°倾角的带有6纳米IPS和150 nm硅纳米柱的NOSP二聚体SEM图；(c)非接触模式TERS；(d)SHINER：壳分离模式；(e)用纳米球印刷术制成的规则SERS基底方法示意图 Fig.4 (a)SEM image of BT-modified Ag-PAO templates obtained by partial dissolution of the alumina matrix in 0.1 M aqueous NaOH; (b)SEM image at a 52° tilted view of the NOSP dimers with a 6-nm IPS and 150-nm Si pillar height; (c)Tip-enhanced Raman spectroscopy: noncontact mode; (d)SHINERS: shell-isolated mode; (e)schematic diagram of template methods using nanosphere lithography to fabricate ordered nanostructured SERS-active substrates

3 SERS生物传感

图5 (a)基于金纳米粒子-金纳米棒复合体检测BPA的SERS适体探针示意图；(b)检测ATP的SERS比率计硅片适体探针示意图；(c)银@介孔硅@银三层核壳结构纳米粒子制备流程示意图；(d)合成19种SERS编码纳米粒子的编码、结构及光谱 Fig.5 (a)Scheme of SERS aptasensor for the detection of BPA based on gold nanoparticle-nanorod heteroassembly; (b)Schematic illustration of the ratiometric silicon SERS aptasensor for ATP detection; (c)proposed preparation process of Ag@MSiO2@Ag TCSNPs; (d)codes, structures and measured spectra of the synthesized 19 SERS encoders

在生物检测应用中，SERS逐渐发展成为一种最常用的多功能方法之一。与其他传统的生物检测手段相比，SERS检测突出的优点包括极窄的峰宽、高灵敏度多元检测能力和较宽的动态范围等。构建功能化的SERS探针是SERS生物应用中的一个重要前提。一般而言，在SERS基底上修饰拉曼分子和特定的生物靶向分子就可以获得面向生物传感应用的SERS光学探针。围绕SERS探针进行的生物传感与检测成为当今研究的热点之一[31]。设计该类探针时要考虑到以下几个方面：SERS活性，靶向效率,纳米结构及光学特性的稳定性及多元检测能力等。为实现特定的生物探测功能，通常会在SERS探针的表面修饰特定的生物靶标分子，如抗体、DNA等。已有报道中，典型的SERS探针结构如图5所示。Feng Jingjing等人将金纳米粒子通过DNA适体连接在金纳米棒两端制成探针[32]，利用在金纳米粒子与金纳米棒之间非常狭窄的缝隙极强的电磁增强得到显著的初始SERS信号(图5(a))。连接二者的适体同时可以作为识别分子与待测物BPA反应而使金纳米粒子从纳米棒上脱离，导致SERS信号的减弱。故这里的SERS信号强度与待测物的浓度成反比关系。类似的结构还有在金纳米星外通过适体DNA连接银纳米粒子而形成卫星型复合结构[33]，其中DNA适体的优点之一是提高了对待测物的靶向性。Shi Huayi等人设计了一种基于适体的探针(图5(b))，可以特异性的识别待测物ATP并形成环状的复合物，从而使一开始与其杂交的两条单链DNA分离，最终导致修饰的两个拉曼分子的SERS信号产生差异而形成SERS比率计型探针[34]。由于靶标分子要识别待测物而使探针整体暴露在环境中，增加了环境中的分子对探针信号影响的风险。Jiang Tao等人在银纳米粒子外包裹一层介孔硅[35]，再在硅壳上吸附一层银纳米粒子形成三层的复合结构，在保证SERS信号强度的前提下提升了探针的稳定性(图5(c))。

图6 (a)A：实验结构示意图。B：基于SERS的侧向流条带实验定量检测HIV-1 DNA的检测原理。(C为对照组，T为实验组)；(b)银纳米金字塔由DNA框架自组装SERS分析生物标志物示意图。C：通过外泌体、磁球和SERS探针间免疫识别形成的三明治结构；(c)利用BODIPY修饰的纳米粒子SERS成像示意图；(d)SERS探针与基因组DNA的杂交原理示意图 Fig.6 (a)A:Schematic illustration of the configuration. B:The measurement principle of the SERS-based lateral flow assay for quantification of HIV-1 DNA.(C is the control line and T is the test line); (b)Scheme of Ag pyramids self-assembled by DNA frame for SERS analysis of biomarkers; (c)schematic representation of the targeted SERS imaging using aza-BODIPY attached to NPs; (d)schematic Illustration of the Hybridization between the SERS Nanoprobes and Genome DNA

在合成出功能化的SERS探针之后，即可利用它们进行目标物的检测。常见的待测物包括DNA、蛋白质、细胞、药物、离子等。DNA作为一种生物标记物在一些疾病诊疗上扮演着重要的角色，而Fu Xiuli等人就选取了HIV-1 DNA作为目标物并设计了侧向流(LF)条带实验来定量检测分析(图6(a))[36]。侧向流条带被认为是一种出色的现场护理诊断工具，其与SERS的联用可以解决低浓度检测等问题，也证明了SERS可以与很多平台兼容互补。在肿瘤标志物的检测中，蛋白质尤其是抗原的检测占据了很大的比例。Liguang等人利用DNA适体将银纳米粒子组装成金字塔结构作为SERS探针[37]，可以检测前列腺抗原(PSA)、凝血酶和粘蛋白三种目标分子(图6(b))。除了小分子的生物标志物，细胞也是SERS进行生物检测的目标之一。Nagappanpillai等人将荧光染料BODIPY当作拉曼分子制成SERS探针并用于检测肿瘤细胞(图6(c))，这种纳米探针的识别效率非常高并且可以进行细胞成像[38]。我们研究组在SERS的生化检测方面也做了大量的研究工作，例如端粒酶活性检测[39]、蛋白质免疫检测[40]、汞离子检测[41]、农药检测[42]等。其中，端粒酶的长度检测实验中用着丝粒的SERS强度作为内标排除其他因素对SERS信号的影响，用端粒酶与着丝粒探针强度的比来确定端粒酶长度(图6(d))。这种SERS原位杂交(in situ hybridization)的灵敏度非常高，可以实现单个端粒酶的检测。

此外，利用SERS光谱十分窄的特点，人们提出了基于SERS的光谱编码技术，生成的光谱码可以用于多元待测物的同时检测。我们提出了一种波长-光强双编码的SERS探针(图5(d))[43]。利用3种拉曼分子的光谱以及强度两类不同信息的组合，可得到多达19种不同的SERS光谱。Lai Yuming等人选了5种拉曼分子进行编码制成SERS探针并用PS微球装载(图7(a))，获得了31种不同光谱编码的PS球[44]。值得注意的是，将SERS光谱与其他光学手段结合可以显著提高可编码容量。例如，我们提出了一种SERS-荧光共编码的光学编码新方法(SFJSE)，并利用有机-金属-量子点复合纳米结构构筑了一类SFJSE光学编码微球作为探针(图7(b))[45]。这种SFJSE编码方案借助荧光-SERS联合光谱拓展了可编码光谱的有效范围，与传统单一荧光信号编码方法相比，可编码数量获得了指数级增长。此外，通过不同种编码分子错层分布的策略简化了编码微球的设计方案，并大大减轻了信号串扰、制备复杂等问题，对于获得大编码容量的微球具有积极意义。

图7 (a)A：硅壳金纳米粒子探针的SERS光谱(左)及拉曼分子的分子结构(右)。B：使用不同拉曼分子的SERS标签典型的拉曼光谱(左)及相应的编码(右)。(b) 合成的15种纳米粒子的构成、光谱和编码 Fig.7 (a)A:SERS spectra of AuNPs-Ra@SiO2(left) and molecular structures of Raman reporters employed in this study(right). B:Typical Raman spectra(left) on microbeads with different types of SERS label using different Raman reporter (10000, 01000, 00100,00010, 00001 and 11111) and their corresponding spectral barcodes(right). (b)Composition, measured spectra, and codes of the synthesized 15 nanoparticles

除了高通量检测本领之外，基底对拉曼散射信号的增强作用使得SERS具有与荧光相当的检测灵敏度。因此，SERS技术在生物传感的应用中展现出了优异的检测性能。另一方面，SERS检测技术也有局限性。比如，SERS检测的步骤相对繁琐以及可重复性相对较低等。因此，开发高效、可重复、自动化的SERS检测技术成为推广SERS实际应用时亟待解决的问题之一。近年来迅速发展的微流控芯片技术为人们提供了一种很好的解决方案。

4 微流控SERS检测芯片及其生物传感应用

微流控芯片可将样品预处理、目标物分选以及检测等多个功能集成到一块芯片上，以流体和阵列多通道的形式缩短分析时间，为大规模高通量生物分析提供高效的实验和检测技术平台。微流控芯片具有高度的自由定制性及可操作性，若将SERS技术与微流控芯片技术结合，即可获得自动化的微流控SERS检测芯片[46]。SERS效应的产生极度依赖于SERS增强基底。因此，微流控SERS检测芯片的一大关键是将SERS基底引入芯片中。根据芯片上SERS基底的类型可以将微流控SERS检测芯片(SERS-LoC)简单地分为三种：液态、固态及原位生长基底芯片。

液态基底是最早在微流控SERS检测芯片中使用的基底。这种基底的操作方法简单，并且可以直接利用微流中液体流动的特性进行散热，从而避免大功率激光对待测分子造成的光热损伤。最简单的方法是直接将制备好的金属纳米粒子通入微流通道内作为SERS检测的基底。如图8(a)，将银胶通入微流通道内时，银胶与修饰拉曼分子的DNA连接，形成基底-拉曼分子结构，最终落在SERS检测区进行检测[47]。液态的SERS基底最显著的优点是可以在微流芯片内流动，从而与拉曼分子充分混合。类似的还有图8(b)中的研究[48]，都是将制备好的金属纳米粒子通入微流通道。在微流控芯片内进行实验，其反应微环境相对可控，增加了实验的可靠性并能在一定程度上可以提高检测的灵敏度。此外，另一种液态基底利用微流控芯片良好的操控性，控制纳米粒子流动并让其聚集在理想的区域或者形成规则密集的聚集体。这些可控的纳米粒子聚集体可以提供大量的SERS热点，因而更有效地增强拉曼信号。目前，这种将流入芯片的纳米粒子捕获在一定区域，并控制纳米粒子的形貌、浓度等特征，使其形成纳米聚集体成为了液态基底的又一研究方向。如图8(c)，在PDMS芯片上设置一个气阀，通过压力控制挤压其变形，从而阻止金纳米粒子通过而聚集在SERS检测区形成聚集体。在检测完毕后释放压力使芯片恢复，则金纳米粒子可以通过并被清洗掉[49]。然而，这种基于阻塞流通的聚集体形成方法对纳米粒子的形貌要求较高，且形成速度较慢。图8(d)给出了另一种可控纳米聚集体的形成方法[50]。Hyundoo等人设计了三层的微流控平台：透明电极上的光导层、液体空腔及接地电极。当光导层被电磁激发时，电流通过光照区域在空腔内形成一个不均匀的电场，致使金属纳米粒子集中起来形成一个聚集体。并且通过改变光照区域可以在不同位置形成SERS基底。这一巧妙的设计可以很方便的将最简单的纳米粒子聚集在微流芯片上形成需要的聚集体作为基底使SERS信号得到极大增强。

在微流芯片内引入液态基底的方法简单方便，但液态基底的显著问题是液体的流动性导致基底形貌不均匀，进而使其产生的热点分布不均衡。后果是同一批次实验通道内不同位置的SERS信号强度差异较大，均一性不好。虽然研究者提出了可重复性的基底作为改进，但能更好的解决这一问题的方案就是使用固态的SERS基底。近年来，由于制作工艺发展突飞猛进，许多应用在PDMS上的固态基底研究被报道出来。如图9(a)，Young等人先用热蒸发法在PDMS上镀一层银，再用氧等离子处理后与玻璃键合形成微流通道。同时氧等离子体处理后可以在平展的银表面生成一些粗糙的微结构以增加热点而增强SERS信号[51]。在这些精心设计的SERS基底中，一些3D等离子体的结构由于其大面积可吸附分析物的性质吸引了很多研究者的注意。如图9(b)，在柱形硅阵列上溅射一层薄薄的银后形成一种被称为纳米柱森林(nanopillar forest)的基底结构被应用在微流芯片内[52]。这一结构最突出的特点是其良好的可重复性，据报道在检测时相对误差只有13%。

图8 (a)集成DNA竞争取代序列检测的SERRS微流微系统。修饰DNA探针-报告分子对的二氧化硅微球(插图)充满一个区块。当目标序列引入到入口时，拉曼分子的链被取代。它们沿着通道流动时与金属纳米聚集体混合并被捕获在微流芯片中的SERRS检测区域。(b)A：基于SERS竞争吸附免疫检测的螺旋线双通道微流传感器示意图。传感器由两个平行的通道组成：一个检测PGA(浅灰)，另一个作对照(深灰)。B：注满四种不同颜色墨水的芯片图像。C：磁性免疫检测的捕获区域图。(c)用带气阀的通道捕获与释放金纳米粒子进行SERS检测的示意图。(d)光电微流SERS光谱。小量样品的光电微流设备集成到一个传统的SERS检测系统。用一个激光光源可以同时达到使金属纳米粒子聚集和SERS信号的检测的目的 Fig.8 (a)Microfluidic SERRS microsystem with integrated competitive displacement for DNA sequence detection. Silica microspheres functionalized with DNA probe-reporter pairs(inset) are packed against a frit. When the target sequence is introduced at the inlet, Raman-labeled reporter oligos are displaced. As they flow along the channel, they are mixed with metal nanoclusters and trapped in the microfluidic SERRS detection region. (b)A:Schematic illustration of the solenoid-embedded dual channel microfluidic sensor for SERS-based competitive immunoassay. The sensor is composed of two parallel channels: one for PGA sensing(light gray) and the other for control(dark gray). B:optical images of the solenoid chip filled with four different colors of inks. C:photograph of the capture area for magnetic immunocomplexes. (c)Schematics of trapping and releasing of gold nanoparticles using a modified pneumatic microvalve for SERS detection. (d)Experimental setup for optoelectrofluidic SERS spectroscopy. An optoelectrofluidic device containing a tiny volume of sample droplet is integrated into a conventional SERS detection system. Both concentration of metal nanoparticles for SERS enhancement and detection of SERS signal are simultaneously achieved with a single laser source

图9 (a)光流控芯片的制做流程；(b)纳米柱森林的制造流程及其SEM图 Fig.9 (a)Device fabrication of the optofluidic SERS chip; (b)Fabrication process for nanopillar forests and SEM images of the obtained nanopillars

图10 (a)在微流芯片内激光制造SMA的示意图；(b)A：微流芯片内三个模块示意图，分别用红、绿和蓝色方块表示注射、混合和光学检测功能区。B：光引导银纳米聚集体的形成过程及原位SERS检测。注射区的硝酸银、水、CV和柠檬酸钠溶液用不同颜色表示。微流通道内的流动用白色箭头指示 Fig.10 (a)Scheme for laser fabrication of SMAs inside a microfluidic channel; (b)A:schematic of microfluidic chip with three modules functioning as injection, mixing, and optical detection marked by the red, green, and blue squares, respectively. B:the procedure of photoinduced growth of silver nanoaggregates and in situ SERS measurements. The solutions of AgNO3, H2O, CV and sodium citrate in the injection module are represented by different colors. The flow in the microchannel is indicated by the white arrows

此外，还有一类微流控芯片直接在微流芯片内部实现基底的制备并用于检测，被称作原位(in situ)生长的SERS基底。如图10(a)，Xu B B等人用飞秒激光器引导光致还原[53]，在通道内生成银微花形结构阵列，每一个单体的表面都非常粗糙，以此为基底可以产生很强的SERS增强效果。类似的，Yan W等人在微流内利用光化学还原银纳米聚集体[54]，并发现在第一次光照还原生成纳米粒子后将其洗去接着第二次在相同的激光下再次生成大量细小的银纳米粒子，这一关键的步骤直接导致在通道内产生了大量的热点，而使得在检测SERS信号时可以增强一个数量级(图10(b))。

随着微流芯片内SERS基底制备技术的不断改进与优化，SERS信号的灵敏度、特异性和可重复性得到了进一步的改善。微流控芯片与SERS技术二者的协同作用使得SERS-微流芯片(SERS-LoC)的应用越来越广泛[55]。

4.1 生物检测

SERS的特异性与无损特性使其非常适合生物医学方面的研究。再加上微流芯片的稳定性、灵活性与微量样品检测的特性，目前，SERS-LoC的生物检测应用取得了不少突出的进展[56-67]。

图11 (a)在硅片上修饰银纳米粒子作为基底集成在微流芯片上，A：一步法，B：两步法检测miRNA；(b)基于SERS的液滴微流传感器免清洗的磁性免疫检测示意图。这种传感器由5个部分组成，功能如下：i液滴生成及试剂混合；ii形成磁性免疫复合物；iii磁铁分离免疫复合物；iv含有上清的更大的液滴生成来进行SERS检测；v含有磁性免疫复合物的更小的液滴生成；(c)微流芯片构成及概念示意图。细胞预先标记肿瘤特异性与对照探针(后者两种细胞都有修饰)，再注入芯片中，流向中心汇集后通过拉曼激光照射；(d)微流芯片示意图：A：顶视图 B：侧视图。这一设备有两层：液体流动层(黑线)和调节流动层连接的控制层(粉色和蓝色图案)。在侧视图中芯片由3个功能区域组成。区域I：细胞培养池(癌细胞)；区域II：抗体条码(不同通道内基底与抗体相匹配)；区域III：细胞培养池(免疫细胞被基底上的抗体捕获) Fig.11 (a)Microfluidic chip integrating pSi membranes decorated by Ag NPs and detection schemes of miRNA by A:one-step hybridization assay, B:two-step hybridization assay; (b)schematic illustration of the SERS-based microdroplet sensor for wash-free magnetic immunoassay. The sensor is composed of five compartments with the following functions: (i)droplet generation and reagent mixing, (ii)formation of magnetic immunocomplexes, (iii)magnetic bar-mediated isolation of immunocomplexes, (iv)generation of larger droplets containing the supernatant for SERS detection and (v)generation of smaller droplets containing magnetic immunocomplexes; (c)schematic of setup and concept. Cells, prelabeled with a cocktail of cancer-specific(NRP) and control(UC) SBTs (the latter binding both cell types), are injected into the device, where they are flow-focused before passing through the Raman laser; (d)schematic illustration of a microfluidic chip: A: top view and B: side view. The device contains two layers: a flow layer (black line) for transport of fluids and a control layer(pink and blue pattern) to regulate the connections in the flow layer. In the side view, the chip is composed of three functional sections. Section I the cell culture chamber (cancer cells); section II:antibody barcode(the substrate is patterned with various antibodies in different channels); section III:the cell culture chamber(immune cells are captured by the antibody on the substrate)

与在溶液中类似的检测原理，在微流控芯片中也可以利用SERS光谱来进行生物标志物的检测。miRNA是一种控制基因表达的非编码RNA，参与了生物体的很多过程。Novara C等人在微流芯片上制作了两种SERS基底(图11(a))，分别检测带拉曼标记的miRNA和无标记的miRNA[58]。抗原作为最重要的肿瘤标志物之一也被引入到SERS微流芯片中。Gao R等人制作了液滴的微流系统(图11(b))，将磁球作为捕获基底，同时加入待测物PSA和SERS探针后在微流内充分混合[59]。最后用磁铁将反应生成的磁球-PSA-探针免疫复合物分离，通过检测通道内剩余探针的SERS信号来反映待测物的浓度。微流控芯片的一大优势是可以模拟体液流动环境，这给识别并收集体内的循环肿瘤细胞(CTC)提供了研究平台。Pallaoro Alessia等人在微流通道内注入肿瘤细胞与正常细胞的混合液并使其排成一列流动(图11(c))，通过激光照射区域得到SERS信号并利用两种分析方法即主成分分析(PCA)和最小二乘法进行分析[60]。除了直接对细胞进行识别和分析，检测细胞分泌物作为研究细胞间通信的基础也是生物检测分析的一大课题。我们也提出了一种SERS微流芯片内用于实时监测细胞间通信的方法(图11(d))[61-62]。该芯片结合了SERS光谱编码技术与蛋白质阵列的空间编码技术，将大量待测样品中蛋白质的种类和含量信息加载到基于SERS的三维码中，只需通过三维码的解码即可获取所有样品中各种蛋白质的含量信息，该检测平台具有信息量大、检测灵敏度高(～10 fg/mL)、响应速度快(30 min)、操作简便等优点。

4.2 离子检测

小分子或离子的检测要求检测方法具有优异的可靠性与灵敏度。SERS-LoC的一系列优秀的特性使其成为检测小分子或离子的非常有力的工具[63]。

硫氰酸离子作为评价人体健康的重要标记分子广泛存在于体液中，检测体内硫氰酸离子的浓度对临床诊断与疾病预防很有意义。砷作为一种环境中普遍存在的污染物影响着人们的健康，图12(a)中展示了一种间接检测砷离子的策略[64]。Nan等人将银纳米粒子修饰谷胱甘肽(GSH)和拉曼分子作为探针，在之字形微流通道内使砷离子与探针充分混合，其中砷离子与谷胱甘肽结合可以导致银粒子的聚集从而增强SERS信号。这种方法可以检测低至6.7×10-10g/mL的砷离子。我们设计了一种液滴SERS微流控系统[65]，将样品与银壳金纳米棒混合形成液滴在通道内流动并进行快速的SERS检测(图12(b))。这种方法在人血清中检测动态范围达到4到256 μM并可以实现真实唾液样本的检测。

图12 (a)A：用来检测砷离子的微流芯片示意图。砷离子与GSH/4-MPY修饰的纳米粒子在之字形微流通道内快速、充分混合(插图)。B：砷离子的分析原理。当砷离子与GSH/4-MPY修饰的纳米粒子耦合时发生聚集，银纳米粒子上的4-MPY的拉曼信号被增强；(b)A：液滴微流设备的示意图。B：银壳金纳米棒的SERS光谱(红色)及加入硫氰酸离子后的SERS光谱(蓝色) Fig.12 (a)A:schematic diagram of the microfluidic chip used for analyzing the As(III) ions. The rapid, full mixing of the As(III) ions and GSH/4-MPY functionalized AgNPs achieved in a zigzag(75 angles) microfluidic channel(inset). B:the analytical principle for As(III) ions. When As(III) ions couple with GSH/4-MPY functionalized AgNPs, aggregation occurs and the Raman signals are improved when 4-MPY is adsorbed on the surface of the AgNPs; (b)A:schematic illustration of the droplet microfluidic device. B:SERS spectra of CTAB-stabilized Au@Ag NRs(red curve) and Au@Ag NRs with the addition of SCN-(blue curve)

4.3 便携的SERS-LoC

利用高集成度的芯片可以在一块芯片上完成整个复杂的实验，使得微流芯片直接代替了实验室的环境，微小的尺寸使其有很好的便携性，可在任意地方进行实验。然而对于SERS而言，由于检测时需要光学校准和对焦等复杂过程，将SERS-LoC做成便携的设备成为不小的挑战。近来，光流控(optofluidic)的发展解决了这一困难[66]。如图13(a)，Soroush等人将光纤元件集成到微流芯片上消除了SERS检测时光学对焦等负担[67]，使现场(on-site)SERS检测成为可能。除此之外，手持的拉曼光谱仪也可以用来实现SERS的现场分析[68]。图13(b)显示了Kim等人提出的将芯片内的纳米柱阵列作为SERS基底，运用手掌大小的便携拉曼光谱仪进行在现场的SERS检测牛奶中的三聚氰胺[69]。这种简便的拉曼光谱仪并没有降低检测灵敏度，实验在水溶液中检测限达到1.2×10-10g/mL，而在奶粉提取物中检测限为1.0×10-10g/mL，均达到了FDA要求的标准。随着更多简易方便的平台被研究出来[70]，为现场SERS检测而准备的便携设备越来越成熟。

图13 (a)A：光流控SERS微系统示意图。B：光流控SERS系统。C：充满的微球和集成的光纤；(b)牛奶中三聚氰胺检测的比较使用A：标准的FDA过程和B：我们的纳米柱检测方案。在显示金纳米柱芯片用于分子检测同时展示的具有代表性的SEM图为打开(左)和关闭(右)的金纳米柱五聚物分别对应处理过滤的牛奶前后 Fig.13 (a)A:schematic of optofluidic SERS microsystem. B:photo of optofluidic SERS microsystem. C:micrograph of packed microspheres and integrated fiber optic cables; (b)Comparison of melamine sensing in milk using A:a standard FDA procedure versus B: our nanofinger-based sensing solution. The representative SEM images of open(left) and closed(right) pentamer gold nanofingers before and after treatment with the filtered milk, respectively, are shown along with the illustration of how the gold nanofinger chips were used for molecular sensing

5 结束语

综上所述，本文简单介绍了SERS的原理，着重从基底的设计上叙述了SERS的发展。接下来总结了几种SERS在生物传感中的应用，主要从SERS探针的制备和不同待测物的检测两方面进行概述。通过将SERS基底引入到微流芯片内形成微流控SERS检测芯片(SERS-LoC)。在微流控SERS检测芯片中，无论是液态、固态还是原位生长的SERS基底都有其特点及应用背景。最后，我们讨论了目前微流控SERS检测芯片的几种应用。检测的分析物有DNA、抗原、生物标志物、细胞、汞离子、砷离子等。随着科学技术的发展SERS-LoC系统也逐渐趋于便携性，出现了手持的设备，为真正的on-site现场检测提供了有力帮助。

尽管微流控SERS检测芯片已经取得了引人注目的研究进展，然而检测特异性与可重复性、芯片的多功能化与集成度的提高等依旧是微流控SERS检测芯片今后的研究目标。尤其是如何直接使用实际临床生物样本进行目标物的检测。实际临床样品(如病人的血液)很复杂，它们往往含有丰富的蛋白质、DNA等。这些生物大分子在SERS检测的过程中都有可能提供非特异性的噪声信号，从而造成假阳性或假阴性的检测结果，严重影响检测结果的可靠性。因此，对于实际样品来说，微流控SERS检测芯片的特异性问题尤为重要。通常，解决微流控SERS检测芯片的特异性问题可从两点出发。首先，优化SERS基底或探针的生物功能化修饰，提高基底或探针识别待测物的选择性和准确性；其次，在微流芯片内增加可对待测物进行筛选的功能单元，例如物理尺寸筛选或化学配体识别筛选，尽可能地排除其他物质的非特异性干扰。若微流控SERS检测芯片能够对实际的复杂生物样品进行高准确性地测试，则必将极大地推进微流控SERS检测芯片在临床诊断与治疗中的应用。此外，低成本的自动化微流控SERS检测芯片也是今后人们研究的重点目标之一。其关键是如何在保证完善的传感与分析功能的前提下，尽可能降低芯片的制作成本。低成本的微流控SERS芯片对于欠发达地区的生化检测(如疾病普查、环境监测等)具有非常重要的社会价值与现实意义。在将来，SERS与微流控芯片技术进一步发展，如将激光、光谱仪等设备集成到芯片上后会更大程度上发挥SERS-LoC的作用，为现场实时检测技术的完善作出巨大贡献，届时生命健康科学、生物医学等方面会极大受益。可以预见的是，随着功能的不断完善和性能的不断提高，集成的、自动化的SERS-LoC芯片必然会成为生物传感检测领域中一项非常重要的技术。

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