DC-SIGN在原发性肝癌组织中的表达及意义

谢达飞 袁佩文

(浙江医院普外科，浙江 杭州 310013)

原发性肝癌的主要治疗方法为以手术为主的综合治疗，原发性肝癌恶性程度比较高，对放化疗不敏感，手术切除后复发率比较高，随着细胞生物学、分子生物学和人类基因组学等学科的不断发展，基因免疫治疗在原发性肝癌治疗中的作用越来越受到重视，基因免疫治疗有可能成为原发性肝癌的有效治疗方法〔1，2〕，以树突细胞为基础的免疫治疗在肝癌的免疫治疗中的作用越来越受到关注〔3，4〕，通过肿瘤细胞负载树突细胞制备疫苗在原发性肝癌中的研究取得一定效果。树突细胞特异性细胞间黏附分子3结合的非整合素(DC-SIGN)是树突细胞的C型凝集素的主要成员，是一种多功能免疫分子，在肿瘤的免疫逃逸和免疫应答等方面发挥重要作用〔5，6〕，DC-SIGN在肿瘤免疫逃逸和免疫反应中为肿瘤的基因免疫治疗提供新思路，但DC-SIGN在原发性肝癌发病中的作用尚不十分清楚。本文对原发性肝癌组织中DC-SIGN的表达及临床意义进行研究。

1 材料与方法

1.1材料 选择浙江医院普外科2013年1月至2015年12月原发性肝癌患者手术切除的肝癌组织标本30例及对应的距离肝癌组织2 cm以上的癌旁肝组织标本30例。30例肝癌患者年龄(48.36±11.24)岁；男25例，女5例；有包膜17例，无包膜或包膜不完整13例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例；中高分化20例，低未分化10例；肿瘤<5 cm者19例，≥5 cm者11例；有静脉侵犯者13例，无静脉侵犯者17例。纳入标准：所有患者经病理证实为原发性肝癌，签署知情同意书，经伦理委员会审批。主要试剂：兔抗人DC-SIGN抗体、鼠抗人DC-SIGN单克隆抗体、兔抗鼠β-actin抗体、山羊抗兔二抗(美国R&D公司)，柠檬酸盐缓冲粉末、过氧化氢水、苏木素、封闭血清(北京中山金桥生物科技公司)，DC-SIGN引物、GAPDH引物、RT-PCR试剂盒(美国Invitrogen.Inc)等。

1.2肝癌组织和癌旁组织中DC-SIGN蛋白表达检测 取肝癌组织和癌旁组织石蜡块，4 μm厚，放入烤箱烤片30 min，脱蜡、水化、冲洗后，将切片放入沸腾的柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，将切片放入过氧化氢去离子水中孵育30 min清除内源性过氧化物酶，冲洗、封闭，加入一抗兔抗人DC-SIGN抗体，空白对照不加一抗，过夜孵育，冲洗后加入山羊抗兔抗体二抗孵育，冲洗、显色，加入苏木素复染，脱水封片，每张肝癌组织和癌旁组织随机选5个视野，高倍镜下拍照，采用IPP软件计算光密度值，免疫组化DC-SIGN蛋白表达量以平均光密度值表示。

1.3肝癌组织和癌旁组织中DC-SIGN mRNA表达测定 提取肝癌组织和癌旁组织标本总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板采用RT-PCR法测定肝癌组织和癌旁组织中DC-SIGN mRNA水平，以β-actin为内参，RT-PCR反应条件为：94℃预变性2 min，94℃30 s、55℃1 min、72℃1 min，共30个循环，72℃延伸1 min。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0统计学分析软件进行t检验。

2 结 果

2.1肝癌组织和癌旁组织中DC-SIGN蛋白的表达 肝癌组织中DC-SIGN蛋白光密度值明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(t=181.289，P=0.000)。

2.2肝癌组织和癌旁组织中DC-SIGN mRNA的表达 肝癌组织中DC-SIGN mRNA相对表达量(1.63±0.34)明显高于癌旁组织(1.00±0.01)，差异有统计学意义(t=10.145，P=0.000)。

2.3肝癌组织DC-SIGN蛋白表达与临床病理特征的关系 肝癌组织DC-SIGN蛋白表达与肝癌包膜、TNM分期、血清甲胎蛋白(AFP)水平有关(P<0.05)，与肝癌患者的年龄、性别、组织分化、肿瘤大小、静脉侵犯无关(P>0.05)。见表1。

2.4肝癌组织DC-SIGN mRNA表达与临床病理特征的关系 肝癌组织DC-SIGN mRNA表达与肝癌包膜、TNM分期、血清AFP水平有关(P<0.05)，与肝癌患者的年龄、性别、组织分化、肿瘤大小、静脉侵犯无关(P>0.05)。见表2。

表1 肝癌组织DC-SIGN蛋白表达与临床病理特征的关系

表2 肝癌组织DC-SIGN mRNA表达与临床病理特征的关系

3 讨 论

树突细胞可通过其表面抗原受体参与T细胞的激活、增殖和分化而引起机体免疫应答，也可通过与肿瘤细胞或病原体相互作用使肿瘤细胞或病原体产生免疫逃逸；树突细胞的免疫调节作用和树突细胞表面的受体分子有关，其表面的分子受体主要有C型凝集素受体和Toll样受体两大家族，DC-SIGN为树突细胞C型凝集素受体的主要成员，是一种具有多种功能的免疫分子，在树突细胞的免疫调节中发挥重要作用〔7，8〕。DC-SIGN是一种Ⅱ型跨膜蛋白质，分为胞质区、跨膜区和胞外区，由404个氨基酸组成，胞质区调节抗原内化过程，并参与信号转导；跨膜区参与DC-SIGN在细胞膜上定位；胞外区有颈结构域和糖识别域组成，颈结构域参与DC-SIGN与糖配体结合，糖识别域可识别并结合糖类抗原〔9，10〕。

DC-SIGN在树突细胞的迁移、激活T细胞、炎症反应、启动免疫应答、肿瘤细胞及病原体的免疫逃逸及免疫应答中发挥重要作用〔11，12〕。在正常细胞恶变的过程中，随着细胞表面分子的异常糖基化，DC-SIGN对糖基进行识别，在肿瘤抗原的呈递过程中发挥作用；DC-SIGN可识别肿瘤细胞特异性抗原相关细胞黏附分子，从而介导非成熟树突细胞对肿瘤细胞内化摄入，从而发生免疫逃逸〔13，14〕。DC-SIGN还参与多种微生物感染〔15〕，高甘露糖结构可被高表达DC-SIGN的未成熟树突细胞识别，从而对其内摄，发生免疫逃避。肿瘤细胞存在病原体类似的机制，在结肠癌中也存在DC-SIGN高表达现象，DC-SIGN在结肠癌中可能也参与结肠癌的免疫逃逸〔16〕。本研究表明DC-SIGN参与原发性肝癌的发生发展，在无包膜或包膜不完整肝癌组织中DC-SIGN表达量比较高，在肝癌分期比较高的肝癌组织中DC-SIGN表达量也比较高。DC-SIGN在原发性肝癌组织中的作用机制尚不清楚，是否与免疫逃逸有关尚需进一步研究。

4 参考文献

1Li S，Yang F，Ren X.Immunotherapy for hepatocellular carcinoma〔J〕.Drug Discov Ther，2015；9(5)：363-71.

2Prieto J，Melero I，Sangro B.Immunological landscape and immunotherapy of hepatocellular carcinoma〔J〕.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2015；12(12)：681-700.

3Sun TY，Yan W，Yang CM，etal.Clinical research on dendritic cell vaccines to prevent postoperative recurrence and metastasis of liver cancer〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(4)：16222-32.

4El Ansary M，Mogawer S，Elhamid SA，etal.Immunotherapy by autologous dendritic cell vaccine in patients with advanced HCC〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2013；139(1)：39-48.

5Amin R，Mourcin F，Uhel F，etal.DC-SIGN-expressing macrophages trigger activation of mannosylated IgM B-cell receptor in follicular lymphoma〔J〕.Blood，2015；126(16)：1911-20.

6Varga N，Sutkeviciute I，Ribeiro-Viana R，etal.A multivalent inhibitor of the DC-SIGN dependent uptake of HIV-1 and Dengue virus〔J〕.Biomaterials，2014；35(13)：4175-84.

7Garcia-Vallejo JJ，van Kooyk Y.The physiological role of DC-SIGN：a tale of mice and men〔J〕.Trends Immunol，2013；34(10)：482-6.

8Ordanini S，Varga N，Porkolab V，etal.Designing nanomolar antagonists of DC-SIGN-mediated HIV infection：ligand presentation using molecular rods〔J〕.Chem Commun (Camb)，2015；51(18)：3816-9.

9周 娜，韩忠燕，王 健.胎盘Hofbauer细胞与HBV宫内感染〔J〕.中国微生态学杂志，2014；26(4)：475-8.

10Simon AY，Sutherland MR，Pryzdial EL.Dengue virus binding and replication by platelets〔J〕.Blood，2015；126(3)：378-85.

11张 硕，李建东，曲 靖，等.发热伴血小板减少综合征病毒细胞表面受体的初步研究〔J〕.微生物与感染，2014；9(2)：112-5.

12Chao PZ，Hsieh MS，Cheng CW，etal.Dendritic cells respond to nasopharygeal carcinoma cells through annexin A2-recognizing DC-SIGN〔J〕.Oncotarget，2015；6(1)：159-70.

13Zhao LJ，Wang W，Ren H，etal.ERK signaling is triggered by hepatitis C virus E2 protein through DC-SIGN〔J〕.Cell Stress Chaperones，2013；18(4)：495-501.

14Odegard JM，Kelley-Clarke B，Tareen SU，etal.Virological and preclinical characterization of a dendritic cell targeting，integration-deficient lentiviral vector for cancer immunotherapy〔J〕.J Immunother，2015；38(2)：41-53.

15Goncalves AR，Moraz ML，Pasquato A，etal.Role of DC-SIGN in Lassa virus entry into human dendritic cells〔J〕.J Virol，2013；87(21)：11504-15.

16张长福，姜艳梅，姜旭东，等.DC-SIGN与结肠癌的生长〔J〕.生命科学，2013；25(9)：886-90.