地稔预处理对大鼠肢体缺血再灌注损伤的保护作用

许荣成，王济纬，兰 俊，陈 科

药物预处理是近年来提出的一个比较新的概念，在心肌缺血再灌注损伤的治疗中应用较多，旨在通过药物提前干预以促使机体释放相关的生物活性物质，增强心脏对缺血缺氧的耐受，达到保护作用[1]。有学者提出中药黄芪、姜黄素、芍药苷等预处理有改善心肌缺血再灌注损伤的作用[2-3]。地稔为野牡丹科地被植物，可以通过降低脂质过氧化，提高机体清除氧自由基能力来减轻CCl4所致的小鼠肝损伤[4]。但对肢体缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury of limb，IRIL）是否具有改善仍鲜见报道。本实验研究其对大鼠IRIL的保护作用，探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8周龄成年健康SD大鼠，雌雄各半，分笼饲养，体重200～250 g，由温州医科大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（浙）2010-0150。

1.1.2 主要药物与试剂 地稔全草，由丽水市畲族医药研究所提供。原药材1000 g经煎煮、滤过后浓缩至1 g生药/mL的地稔全草浓缩液，置于冰箱冷藏。实验用地稔水煎液由浓缩液+纯水稀释配制而成，浓度0.2 g/mL。试剂：细胞间黏附分子1（ICAM-1，批号238960234）、白细胞介素6（IL-6，批号230660752）和肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号238260734），试剂盒均购自杭州联科生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 南京SOPTOP舜宇显微镜ST60；上海手术器械厂800型离心机；ACLTOP300CTS全自动血凝分析仪；Mutuskan MK3酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 30只SD大鼠，按照随机数字表法随机分为3组：对照组（CG）、模型组（IR）、治疗组（MD），每组10只。适应性饲养1周，治疗组于术前5 d开始灌胃给药，剂量为10 mL/kg/次，1次/d，连续5 d。对照组与模型组予等量0.9%氯化钠注射液（10 mL/kg/次）灌胃。

1.2.2 模型制备 术前12 h禁食，自由饮水。采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔内注射麻醉。仰卧位，四肢外展固定。于右腹股沟处备皮、消毒，剪开皮肤。在手术显微镜下分离显露出右侧股动脉，予无创动脉夹夹闭。显微镜下确认阻断动脉血流，缝合切口。操作过程中注意保护股静脉及股神经。同时予以右大腿根部橡皮带环扎，阻断侧支循环。通过观察大鼠右后肢趾端皮肤颜色及皮温，并与左侧对比。动脉阻断成功，可见趾端皮肤青紫，发凉。缺血4 h后松解橡皮带，取出动脉夹，并再次在显微镜下检查血管通畅程度，以确认恢复右下肢血流再灌注。其中，对照组麻醉后仅做股动脉的分离，不夹闭，不捆扎。各组再灌注4 h后，取血进行各项指标的检测。

1.2.3 凝血功能检测 再灌注4 h后，麻醉状态下，大鼠心尖取血1.8 mL入含有3.8%构椽酸钠真空采血管中，采用ACLTOP300CTS全自动血凝分析仪检测凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（Fib）及血浆凝血酶时间（TT）。

1.2.4 血清指标检测 再次心尖取血4 mL入促凝管，静置30 min待血清析出，放入离心机经3000 r/min离心10 min，取上清液。ELISA法检测ICAM-1、IL-6和TNF-α含量。具体操作步骤严格按照各试剂盒说明书。

1.3 统计学处理 运用SPSS19.0统计软件对数据进行分析，计量资料先采用Shapiro-Wilk检验判断数据是否为正态分布，所有数据均呈正态分布且方差齐性，以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地稔预处理对各组大鼠凝血功能的影响 与CG组相比，IR组PT、TT和APTT显著缩短（P＜0.05），Fib含量增加（P＜0.05）；与IR组比较，MD组TT和APTT明显延长（P＜0.05），PT显著延长（P＜0.01），Fib含量显著减少（P＜0.01）。详见表 1。总的组间P值：PT（P=0.002）；TT（P=0.029）；APTT（P=0.042）；Fib（P=0.013）。

表1 各组大鼠凝血功能比较（，n=10）

表1 各组大鼠凝血功能比较（，n=10）

注：与CG组比较，aP＜0.05；与IR组比较，bP＜0.05 bbP＜0.01

组别 PT(s) APTT(s) TT(s) Fib(g/L)CG 组 9.84±0.69 24.06±5.02 22.38±3.99 1.78±0.23 IR 组 8.99±0.64a 19.55±3.74a 18.84±3.11a 2.05±0.24a MD 组 10.03±0.56bb 23.97±4.56b 22.45±3.23b 1.76±0.21bb

2.2 地稔对大鼠血清炎症因子ICAM-1、IL-6及TNF-α的影响 与CG组相比，IR组血清中炎症指标ICAM-1、IL-6及TNF-α表达水平显著上升（P＜0.05）；MD 组 ICAM-1、IL-6 及 TNF-α含量则显著降低，与IR组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2。总的组间P值：ICAM-1（P=0.001）；IL-6（P=0.001）；TNF-α（P=0.003）。

表2 各组大鼠血清炎症因子ICAM-1、IL-6及TNF-α的含量比较（，n=10，pg/mL）

表2 各组大鼠血清炎症因子ICAM-1、IL-6及TNF-α的含量比较（，n=10，pg/mL）

注：与CG组比较，aP＜0.05；与IR组比较，bP＜0.05 bbP＜0.01

组别 ICAM-1 IL-6 TNF-α CG 组 608.25±47.90 73.19±6.09 28.20±3.17 IR 组 728.41±96.68a 89.04±7.31a 38.85±3.15a MD 组 603.05±44.09bb 76.50±6.92bb 30.85±4.33bb

3 讨论

IRIL多见于挤压伤、术中止血带的使用、断肢再植等，与氧自由基的释放、细胞内钙超载、白细胞的迁移等有关[5]，具有极其复杂的病理生理过程。有研究发现，IRIL过程中产生的血小板活化因子不仅可直接作用于血管壁，使血管通透性增加，还可诱导血小板聚集[6]。缺血预处理由Murry等于1986年首次提出，即短暂而反复的缺血和再灌注不会造成损伤的叠加，反而可以提高心肌组织对缺血缺氧的耐受性[7]。由于伦理学原因，这一理论在临床应用受到了一定的限制，于是又有学者提出了药物预处理[8]。已被证实有此作用的药物有去甲肾上腺素、七氟醚等，另外，常用的预处理药物如黄芪[9]、丹参[10]、芍药苷[11]等，均对缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。地稔作为畲族常用药材，具有祛瘀利湿、清热解毒之功效。其化学成分主要有多糖、黄酮类、酚类等[12]。有学者提出，地稔水煎液还有明显的镇痛、抗炎[13]、止血凝血作用[14-15]。本研究采用术前5 d地稔全草水煎液预处理的方式，观察地稔对IRIL大鼠的凝血功能及相关炎症因子的影响。

严重的IRIL会引起全身炎性反应综合征[16]，造成机体代谢及凝血功能的障碍，伴发器官功能障碍或衰竭，严重者可致死。IRIL对机体凝血和纤溶系统均有显著的影响，在引起血液高凝的同时又抑制了纤溶活性[17]。主要体现在体内纤溶酶原激活剂表达下降，TT和APTT的缩短。本研究结果显示，肢体缺血再灌注后，PT、TT和APTT显著缩短，Fib含量上升（P＜0.05），提示机体处于高凝状态，纤溶受抑。与IR组比较，地稔的提前干预，则改变了这种状态，使得TT和APTT延长（P＜0.05），PT显著延长（P＜0.01），Fib明显减少（P＜0.01）。APTT和PT主要反映内、外源性凝血系统状况，FIB反映了纤维蛋白原含量。本研究提示，地稔预处理对IRIL大鼠的内、外源性凝血系统都有作用，且能改善纤溶系统活性。

ICAM-1是一种单链糖蛋白，属黏附分子免疫球蛋白超家族类。广泛分布于体内多种细胞，如血管内皮细胞、各种上皮细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞等。近年来的诸多研究都表明，ICAM-1在缺血再灌注损伤中起着十分重要的作用[18]。其主要功能是介导白细胞与血管内皮细胞的黏附[19]，促使白细胞浸润与聚集于缺血组织，阻塞血管，导致血管收缩，减少血流量，同时释放出自由基等毒性物质，进一步加重缺血细胞的损伤。TNF-α和IL-6作为体内重要的炎症因子，对机体的许多炎症反应和免疫反应都有调节和介导作用。其中IL-6是单核巨噬细胞和其他细胞在TNF-α的刺激下分泌的，是急性炎症反应的重要介质，其主要作用为对多种细胞的促炎作用和对肝组织的诱导，促使合成多种急性时相蛋白[20]。IL-6的增多可刺激中性粒细胞和内皮细胞中ICAM-1的表达,诱导中性粒细胞功能上调，造成缺血组织的损伤[21]。正常情况下体内TNF-α浓度较低，具有抗感染、抗肿瘤、调节免疫等多种生理功能，具有一定的保护作用。而TNF-α浓度升高后，就成为了重要的炎症递质，诱导 IL-6、IL-8的表达，在许多炎症反应中发挥作用，造成器官及系统受损[22]。

在本实验中，模型组大鼠血清中ICAM-1、TNF-α和IL-6含量均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。这就进一步证实，在缺血再灌注对机体造成损伤时，上述炎症因子发挥了重要作用。而经过地稔预处理后的大鼠在面临IRIL时，体内的炎症反应就相对减轻许多，从而机体的损害也会较少，体现在ICAM-1、TNF-α和IL-6表达的下降，并且与IR组比，存在显著差异（P＜0.01）。因此，地稔水煎液的预处理在改善肢体缺血再灌注损伤大鼠血液高凝状态及影响纤溶活性方面有一定作用，同时可以减轻大鼠的炎症反应，其机制可能与降低ICAM-1、TNF-α和IL-6的表达有关。

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