芜菁BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因的克隆与表达

吴元圣，李 雄，杨永平 ，杨永红

(1 云南农业大学 植物保护学院, 昆明 650201；2 云南农业大学 农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室, 昆明 650201；3 中国科学院 昆明植物研究所西南野生生物种质资源库, 昆明 650201)

植物必需矿质元素(如Mg、Fe、Na、Cu、Zn等)在植物中起着广泛的作用，适量的矿质元素对维持植物的正常生长发育有着重要作用，若植物的生长过程中缺少某种必需元素，则植物会发生相应的生理生化变化而影响其生长发育[1-3]。但是这些元素(特别是微量元素)过量的积累也会对植物造成毒害[4]。此外，由于Cd、Pb和Hg等植物非必需金属元素和某些必需矿质元素有类似的化学性质，同样会被植物吸收，从而对植物产生毒害作用[5]。近年来随着重金属污染事件的频繁发生，重金属污染的防治工作越来越受到重视。重金属污染土壤的修复是指利用物理、化学、生物或组合的方法来固定、富集或去除重金属使其浓度降低至无害水平[6]。物理化学方法通常可以带来快速的效果，但大部分成本高且会产生二次污染[7]，因此难以广泛应用。生物修复指通过生物体的代谢活动降低土壤中的重金属浓度，主要通过微生物修复和植物修复来进行[8]。微生物修复具有成本低、环保效益和操作简单等优点[9]。但是微生物修复本身也存在问题，例如微生物生长的环境和收集细菌等问题[10]。因此，植物修复技术已成为近年来的主要选择[11-12]。植物修复是利用植物对重金属的吸附或吸收来降低土壤重金属的生物有效性[13]。植物修复效率很大程度上依赖于植物对重金属的吸收和转运能力，因此研究植物吸收和转运重金属的分子机制，挖掘其中的关键基因具有重要意义。已有研究表明，一些金属转运蛋白参与植物吸收和转运金属离子，这些金属转运蛋白包括P型ATP酶、阳离子扩散促进蛋白(CDF)家族和ATP结合转运蛋白等[14]。

重金属ATP酶(HMA)是P型ATP酶的亚家族之一，能够利用ATP水解释放的能量转运多种重金属穿越细胞膜[14]，是超富集植物依赖的一类重要转运蛋白[15]。在拟南芥和水稻中分别鉴定出了8个和9个HMA蛋白，分别命名为AtHMA1～AtHMA8和OsHMA1～OsHMA9，根据主要转运底物和系统进化关系可以分为2个亚类：Zn/Cd/Co/Pb亚类(包括AtHMA1～AtHMA4和OsHMA1～OsHMA3)和Cu/Ag亚类(包括AtHMA5～AtHMA8和OsHMA4～OsHMA9)[16]。研究表明，HMA家族在维持植物正常条件下微量金属元素的平衡和提高重金属耐受性方面发挥重要的作用[17]。例如：水稻OsHMA2基因突变体对Zn2+和Cd2+的转运能力明显降低[18]。拟南芥和水稻中AtHMA3和OsHMA3基因都能够向根液泡中转运Cd2+，从而减少Cd2+向地上组织的转移[19-21]。AtHMA4基因在调节拟南芥中Cd2+和Zn2+的含量具有重要作用，能够介导Cd2+和Zn2+通过木质部向茎尖的转运[22-23]。与大多数HMA成员功能不同的是，水稻中OsHMA9基因能够将细胞内的Cd、Zn、Pb等重金属排至胞外[23]。尽管对于模式植物拟南芥和水稻中HMA基因的功能研究开展较早，研究也较为深入，但关于其他植物特别是重金属超富集植物中HMA基因的功能研究还相对较少。

十字花科物种在探索金属离子转运蛋白的功能方面显示出明显的优势。其原因在于(1)该类植物包括模式植物(拟南芥)；(2)许多重要的蔬菜和油料作物基因组数量不断增加；(3)十字花科植物对2种重要的非生物胁迫(盐胁迫和重金属积累)的耐受性差别很大[24-26]。其中，芜菁(Brassicarapavar.rapa)是十字花科芸薹属能形成肉质根的2年生草本植物，在欧洲、亚洲和美洲均有栽培[27]。芜菁和其他十字花科蔬菜作物一样，是土壤中重金属迁移到动物和人体的重要媒介，在重金属和植物的相互作用研究中具有重要角色。前期研究发现芜菁属于Cd2+高积累型植物[28]，但关于芜菁对重金属的耐受或转运的分子机制的研究还很少。本研究从芜菁中克隆得到HMA家族的1对同源基因BrrHMA2.1和BrrHMA2.2，并对其进行生物信息学分析和表达模式分析，为进一步研究HMA家族基因在芜菁吸收和转运重金属过程中的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料为来自四川省乡城县当年采集的成熟芜菁种子。将种子播种在盛有混合营养土的塑料花盆里，每盆播种约3～4粒，共40盆；然后在23 ℃培养箱中黑暗培养36 h，待种子萌发后，移入温室(昼夜温度20/25 ℃；昼夜时间: 8 h/16 h；相对湿度75%～80%)培养5～6周后备用。

1.2 实验方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成选取生长良好的芜菁幼苗，剪取其幼嫩叶片，采用总RNA提取试剂盒(Eastep Super，上海)从芜菁样品中提取总RNA，取RNA样品3 μg，反转录(Promega，上海)合成cDNA第1条链。

1.2.2BrrHMAs基因克隆根据芜菁转录组测序结果预测的CDS序列，设计克隆引物BrrHMA2.1-F(5′-ATGGCGACCAAGAACGAGAA-3′)和BrrHMA2.1-R(5′-ACAGTCACCACCATGAGTGA-3′)，BrrHMA2.2-F(5′-ATGGCGTCCAAGAACGA-TAA-3′)和BrrHMA2.2-R(5′-ATGATCACCACCATGCATGA-3′)，以cDNA第1条链为模板进行BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因全长序列的扩增。PCR产物利用DNA凝胶回收试剂盒(TransGen Biotech，北京)进行纯化回收。将纯化产物连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α并测序。

1.2.3BrrHMAs基因的序列分析利用Swiss Institute of Bioinformatics 网站的ExPASy翻译工具(http://au.expasy.org/tools/dna.html)将全长cDNA序列翻译成蛋白序列；利用NCBI数据库中的Nucleotide Blast进行序列比对分析；用ProtParam工具(http://expasy.org/tools/)在线预测蛋白质的分子量大小、氨基酸组成、等电点及疏水性。用GeneDoc软件进行同源序列比对，InterPro网站预测其结构域。用MEGA6软件选择邻接法(neighbor～joining，NJ)进行系统发育树的构建。

1.2.4表达载体的构建及亚细胞定位以测序正确的BrrHMA2.1/pMD18-T和BrrHMA2.2/pMD18-T重组质粒为模板，用引物BrrHMA2.1-F-101(5′-GACCCCGGGGGTACCGGATCCATGGCGA-CCAAGAAC GAGAA-3′)和BrrHMA2.1-R-101(5′-TCAGAATTCGGATCCTCACTCATGGTGGTGACT-GT-3′)，BrrHMA2.2-F-101(5′-GACCCCGGGGGTACCGGATCCATGGCGTCCAAGAACGATAA-3′)和BrrHMA2.2-R-101(5′-TCAGAATTCGGATCCTCATGCATGGTGGTG-ATCAT-3′)进行PCR扩增，并将PCR产物使用DNA凝胶回收试剂盒纯化。将PCR纯化产物以及空的101GFP载体用BamH I内切酶单酶切，并用连接酶(ClonExpress®Ⅱ One Step Cloning Kit，南京)连接30 min，构建GFP- BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2融合表达载体，转化到大肠杆菌DH5α中并测序确认。构建好的质粒用电击法转化到农杆菌EHA105菌株感受态细胞中。将含重组质粒的农杆菌EHA105通过注射液(含1/2MS、50%蔗糖、0.3% Silwet、乙酰丁香酮，pH 5.7)注射到本氏烟草(NicotianabenthamianaL.)叶片中，正常生长3 d后，利用激光共聚焦显微镜观察叶片下表皮的绿色荧光蛋白(GFP)荧光。

1.2.5BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在芜菁不同生长时期及重金属胁迫处理下的表达分析利用Step one plusTm荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR扩增反应。选取生长18、36、42和50 d的芜菁幼苗和用不同金属胁迫处理(10 mg·L-1MgCl2·6H2O、 2 mg·L-1ZnSO4·7H2O、5 mg·L-1CuSO4·5H2O、2.5 mg·L-1FeCl2·4H2O、2 mg·L-1CoCl2·6H2O、2.5 mg·L-1NaCl、2 mg·L-1CdCl2·2.5H2O)的芜菁幼苗，分别提取叶片和根的总RNA，反转录成cDNA，作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增检测2个基因的表达量。反应体系为20 μL，主要包括：EvaGreen 2X qPCR Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA 2 μL，Free-H2O 6.8 μL。PCR扩增程序: 94 ℃ 预变性30 s，94 ℃ 变性5 s，59 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸34 s，共40个循环。每个反应设3个重复。以芜菁Tubulin基因作为内参，qPCR反应所用引物为qBrrTUB2-F(5′-AGGCGTGTGAGTGAGCAG-TT-3′)和qBrrTUB2-R(5′-CATCTCGTCCATTCCTTC-ACCTGT-3′)；qBrrHMA2.1-F(5′-AAGAACCGTCATCGTCGTCC-3′)和qBrrHMA2.1-R(5′-GAGAAGTACGCCGGAAACCA-3′)；qBrrHMA2.2-F(5′-GTTTCCGGCGTACTTCTCCT-3′)和qBrrHMA2.2-R(5′-GTGACGATGAACTCGCCTCT-3′)。

1.2.6数据分析采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量；利用SPSS 18软件对数据进行统计分析，并采用单因素ANOVA检验；利用SigmaPlot 10.0软件绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 BrrHMAs基因的克隆及生物信息学分析

以芜菁cDNA为模板，设计全长引物进行PCR扩增，将纯化的PCR产物连接到pMD18-T载体后送样品测序，得到BrrHMA2.1和BrrHMA2.2完整的cDNA序列。

Marker. DL5000

BrrHMA2.1基因的全长开放阅读框为2 619 bp(图1)，编码872个氨基酸，将其命名为BrrHMA2.1，序列提交到GenBank，登录号为MG_283237。将该蛋白质的氨基酸序列进行Blast搜索，结果发现该蛋白和白菜(Brassicarapavar.pekinensis)HMA2(登录号为XM_009129842)具有99%的相似性。BrrHMA2.2基因的全长开放阅读框为2 724 bp(图1)，编码907个氨基酸，GenBank登录号为MG_283238，该蛋白和白菜HMA2-like(登录号为XM_009139642)具有99%的相似性。

ProtParam工具预测BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白的分子量分别为94.19和97.45 kD，理论等电点分别为6.69和7.64。序列比对发现，该蛋白含有1个HMA保守结构域。BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白具有6个跨膜螺旋区(图2)。

2.2 BrrHMAs基因的进化分析

采用MEGA6软件的NJ法对BrrHMA2.1、BrrHMA2.2及AtHMA家族10个蛋白进行系统发育分析(图3)。结果表明，BrrHMA2.1、BrrHMA2.2与AtHMA2(GenBank ANM67783.1)的分支关系较近。序列相似的基因可能具有相似的功能。

因此，BrrHMA2.1、BrrHMA2.2基因可能与AtHMA2基因功能相似。

2.3 BrrHMAs蛋白的亚细胞定位分析

为了研究BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在细胞中的作用位置， 本研究构建GFP-BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2表达载体，用农杆菌EHA105菌株将表达载体转化到烟草叶片中。转化3 d后，利用激光共聚焦显微镜观察烟草叶片下表皮中表达载体的表达情况(图4)。研究表明，GFP-BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2融合蛋白在细胞膜上特异表达。

2.4 BrrHMAs基因在不同生长时期的表达分析

为研究BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在不同生长时期的表达情况，本实验取4个不同生长时期芜菁的根和叶，并运用实时荧光定量PCR技术检测其表达量(图5)。研究表明，芜菁随着生长时间的增加，BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在叶中的表达量降低，根中的表达量增加。BrrHMA2.1基因在芜菁生长18 d，叶中的表达量相对于根中较高(P< 0.05)；生长36 d与18 d相比较，叶的表达量降低1倍，根的表达量增加5倍；生长43 d与18 d相比较，叶的表达量降低1倍，根的表达量增加19倍；生长50 d与18 d相比较，叶的表达量降低2倍，根的表达量增加15倍；BrrHMA2.2基因与BrrHMA2.1基因表达结果相似，均在芜菁生长18 d时，叶中表达量高，随着生长时间的增加，在根中的表达量高于叶(P< 0.05)。其中生长43 d时，2个基因在根中的表达量最高。

图3 BrrHMA2.1、BrrHMA2.2与拟南芥AtHMA家族氨基酸序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of BrrHMA2.1, BrrHMA2.2 and Arabidopsis AtHMA family amino acid sequence

2.5 BrrHMAs基因在不同金属胁迫下的表达分析

本实验采用多种金属胁迫处理，通过实时荧光定量PCR技术，检测BrrHMA2.1和BrrHMA2.2在不同金属胁迫条件下的表达(图6)。研究发现，不同金属胁迫条件下，芜菁BrrHMA2.1基因在叶中均表现为下调，明显受多种金属的抑制(P< 0.05)，根中均表现为上调；BrrHMA2.2在叶中均表现为上调，Cu2+、Na+在根中表现为上调，其他均为下调表达。其中，BrrHMA2.1基因在Cd2+、Cu2+、

图中数据为均值±标准误差，不同小写字母表示不同金属处理相同组织在0.05水平存在显著性的差异(P<0.05)The data in the figure is the mean ± standard error, and the different normal letters indicate that there is a significant difference at the 0.05 level for the same tissue treated by different metals(P<0.05)

Na+处理后的叶中显著被下调表达(P< 0.05)；Mg2+、Zn2+、Na+处理后的根中显著上调表达(P< 0.05)；BrrHMA2.2基因在Cd2+处理后的叶中和Cu2+、Na+处理后的根中显著表达(P< 0.05)。与处理前相比，BrrHMA2.1基因Cd2+、Cu2+、Na+在处理后叶中的表达量下调至未处理时的1倍；BrrHMA2.1基因Mg2+、Zn2+、Na+在处理后根中的表达量分别上调至未处理时的11、12、13倍。BrrHMA2.2基因与处理前相比，在叶中的表达量均显著上调，并且在Cd2+中的表达量最高上调至未处理时的5倍。在根中的Cu2+、Na+表达量呈现显著上调，分别是对照的4倍和6倍，其他均呈现下调。由此推测，BrrHMA2.1基因可能参与Cd2+、Zn2+、Na+、Mg2+吸收与转运，BrrHMA2.2基因可能参与Cd2+、Na+、Cu2+的吸收与转运。

3 讨 论

本研究克隆得到芜菁中HMA2的一对同源基因，相对于拟南芥，芜菁中HMA2基因发生了扩增，这和已报道的其他一些基因家族成员的结果一致[28-29]。这可能是因为芜菁进化历史中发生的多倍化事件导致染色体结构或基因数目的变化[30]。在植物进化过程中，HMA基因数量的增加可能与金属耐性和运输的功能有关。研究发现芜菁BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白都定位于细胞膜上，且含有HMA2蛋白所有的保守结构域，这表明芜菁中HMA2基因可能和这些物种HMA2成员具有类似的功能，与拟南芥或水稻的研究结果一致[30-31]。但是由于不同植物对重金属的吸收和转运特性有着很大差异，因此芜菁中HMA2基因的作用机制及2个同源基因之间的作用关系值得深入研究。

由于已经证明植物HMA基因参与多种重金属的积累、运输或外排[15]，包括植物微量元素和非必需元素[32-35]，因此它们可能在维持植物矿物质营养和抵抗重金属污染方面发挥重要作用。芜菁吸收微量元素和重金属Cd的能力较高[28]。因此，研究芜菁对重金属转运的分子机制具有重要意义。其中，AtHMA2与金属具有特别高的亲和力作用[36]。AtHMA2基因在Zn2+和Cd2+转运和吸收过程中具有重要作用[17]。单独敲除AtHMA2导致Zn2+从地下部向地上部的转运减少[17,30]。根据金属依赖转运酶的特性表明，除了Zn2+之外，其它的Cd2+、Pb2+、Ni2+、Co2+和Cu2+等金属离子可能被HMA2激活，这种广泛的金属选择性是Zn-ATP酶常见的[37]。由此推测，BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因可能同样参与Zn2+和Cd2+转运和吸收的过程。本研究发现，芜菁BrrHMA2.1，BrrHMA2.2基因在不同生长时期和不同金属离子处理后在芜菁的根和叶中均能表达。其中，随着生长时间的增加，2个基因的表达量逐渐增加；2个基因在Zn2+、Cd2+等金属胁迫下可以诱导上调表达。

目前，还没有芜菁BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因的研究报道，本研究为后期开展芜菁重金属转运蛋白BrrHMA2.1、BrrHMA2.2的生物学功能研究，深入探讨芜菁体内转运重金属的机制提供实验依据，为芜菁遗传育种及提高产量提供新的思路。

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